原花青素原花青素原花青素原花青素HPLC初步方案初步方案初步方案初步方案
一．实验目的：分析样品原花青素纯度，了解其中杂质成分。

二．实验方案：
1. 方案一：Waters 公司高效液相色谱，C18柱(4.6 ×250 mm) , 检测波长为280 nm，进样量10μL ,柱温为室温。

待测液均经0.45μm 孔径的滤膜过滤。

流动相及流速见下表(A —10 %乙酸,B —重蒸水)：
2. 方案二：（间接法定量）（原理类似铁盐催化比色法）
(1) 标准曲线：称取前花青素标准品10mg 溶于10ml甲醇中,吸取该溶液0、0.1、0.25、0.5、
1.0、1.5ml 置于10ml 容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。

各取1ml 测定。

(2) 试样测定: 将正丁醇与盐酸按95 ：5的体积比混合后,取出6.0ml 置于具塞锥瓶中,再加入0.2ml硫酸铁铵[NH4Fe(SO4) 2·12H2O]溶液（用浓度为2mol/L 盐酸配成2%(w/v)的溶液）和1.0ml 经0.45μm滤膜过滤的试样溶液,混匀,置沸水浴回流,精确加热40min后,立即置冰水中冷却,待进行高效液相色谱分析。

(3)液相色谱参考分析条件: 色谱柱Shimadzu Shim –pak CLC –ODS 4.6 ×150mm;柱温35 ℃;
检测器:紫外检测器,检测波长525nm
流动相: 水:甲醇:异丙醇:10 %甲酸= 73 :13 :6 :8 流速0.9ml/min。

注：该方法使用的水解方法与我们当前使用的铁盐催化水解原花青素方法稍有差异，哪种效果更好，可进行预实验加以比较。

3．方案三：（反相高效液相色谱）标样：原花青素标准品
色谱柱：Hypersi ODS-2 ，150 × 4.6mm 5μm；
流动相：A：0 . 2%(V/V) 乙酸；B：乙腈；
流量：1ml /min；
进样量：5μl;
柱温：30℃；
检测波长：280nm.
洗脱梯度：以乙腈的百分比浓度表示(B液溶于A液)
0 ～5 % ，10min；
5%～20%，10～20min；
20%～40%，20～40min；
40%～50%，40～50min；
50%～5%，45～50min；
5%～0，50～60min。

稳定液配制：取0.5g 抗坏血酸置于1L 容量瓶中，加约500mL 双蒸水，混合，溶解
抗坏血酸。

加入100mL 乙腈，用双蒸水稀释至刻度。

标准品溶液液的配制与稀释均使
用稳定液做溶剂。

通过对HPLC 流动相条件的改进，确定了适合检测葡萄籽超微粉提取液中的没食子
酸、儿茶素、表儿茶素单体的HPLC 流动相条件。

色谱条件:UV 检测器，波长280nm，流速1mL/min，上样量10µl，柱温30℃。

流动相：A，2%乙酸、9%乙腈水溶液；B，
乙腈。

梯度模式：0min →23min →45min →50min →70min，流动相 A 相应浓度梯度为
100% →100% →75% →75% →100%。

稳定液配制：取0.5g 抗坏血酸置于1L 容量瓶中，加约500mL 双蒸水，混合，溶解
抗坏血酸。

加入100mL 乙腈，用双蒸水稀释至刻度。

标准品溶液液的配制与稀释均使
用稳定液做溶剂。

葡萄籽原花青素液相色谱图1-抗坏血酸，2－儿茶素，3－表儿茶素
通过稳定液（主要成分为抗坏血酸）、没食子酸、儿茶素、表儿茶素单独进样确定它们的出峰顺序。

依次的保留时间为 3.29min，4.53min，12.27min，23.42min，
称取0.5g原花青素样品，到100ml容量瓶中！超声溶解，定容至刻度，用毛细管吸取一滴到薄层板上。