吸附量 ＝（初始浓度 － 平衡浓度）×溶液体积 树脂重量
解吸率＝ 洗脱液中原花青素总量 树脂吸附原花青素总量
× １００％
２．３．２ ＡＤＳ－８ 树脂的吸附流出曲线与解吸曲线的绘制 处理后的Ａ Ｄ Ｓ － ８ 树脂于水中湿法装柱，玻璃柱
Ｏ１ １ ． ９ ×４２ｃｍ，其中树脂装填高度３２ｃｍ ，床体积约 ９０ｍｌ。将葡萄籽原花青素粗提物用水稀释至原花青素 浓度分别为５．８、１５．０ｍｇ／ｍｌ，以２ｍｌ／ｍｉｎ流速上样分 步收集流出液（１０ｍｌ／管），测定其中原花青素浓度。 以流出液体积（ＢＶ ）为横坐标、流出液中原花青素浓 度Ｃ与进样原花青素浓度Ｃ０之比（Ｃ／Ｃ０）为纵坐标，绘 制吸附透过曲线。
青素提供参考。
１ 实验材料
１．１ 实验仪器 Ｗａｔｅｒｓ公司高压液相色谱仪，ＨＨＳ型电热恒温水浴
锅，ＳＨＺ－８２水浴恒温振荡器，ＵＶ－２１００紫外／可见分光 光度仪，Ｚ Ｆ Ｑ － ８ ５ Ａ旋转蒸发仪，Ｔ Ｄ ５ Ａ － Ｗ Ｓ台式低速离 心机。 １．２ 实验材料
ＡＢ－８、ＡＤＳ－８和Ｓ－８型大孔树脂，购于南开大学化 工厂；原花青素标准品（浓度≥９５％），购自天津尖峰 天然产物有限公司；葡萄籽是新疆葡萄酒厂下脚料；亚 油酸（不含抗氧化剂，含量≥９０％）由本实验室用红花 油提取；工业级乙醇、Ｔｒｉｓ（三羟甲基氨基甲烷）及所 用其他化学试剂均为分析纯。
洗脱液原花青素浓度（ｍｇ／ｍｌ）
１２０ １００ ８０ ６０ ４０ ２０
０ ０
２０％ 乙醇 ４０％ 乙醇 ５０％ 乙醇
１
２
３
４
５
６
图 ２ ＡＤＳ－８树脂解吸曲线
洗脱液体积（Ｂ Ｖ ）
朱靖蓉等：葡萄籽原花青素的分离纯化及其抗氧化活性研究
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清除率（％ ） Ａ５００ｎｍ
表 ２ 不同浓度乙醇对 ＡＤＳ－８树脂吸附原花青素的解吸率
中抗氧化作用的最常用的体系。图４是高聚和低聚原花 青素对亚油酸体系氧化抑制率（原花青素抗氧化性） 分别为９３．０４％和７６．８８％，而同浓度的ＶＣ及ＶＥ抑制率 分别为３５．５２％和６４．２８％。在所研究的两种聚合度下 原花青素抗氧化效果低于Ｂ Ｈ Ｔ，但与空白对照相比， １０μｇ／ｍｌ浓度时原花青素对亚油酸乳化体系的抗氧化 效果已很明显，而且其抗氧化效果在一定范围内随浓度 的增加而增强，在实际应用中可以通过适当增加其添加 量而达到与Ｂ Ｈ Ｔ相近的抗氧化效果。
看，Ｓ－８树脂对原花青素的解吸回收率很低，很难再洗 脱下来。而ＡＤＳ－８树脂不仅对原花青素吸附量高、解吸 率高，对原花青素的选择性较强而且能够较容易地解吸 下来。所以，从吸附与解吸特性综合衡量，ＡＤＳ－８树脂 优于其它二种吸附树脂，是分离葡萄籽原花青素较理想 的吸附剂，可用于原花青素的层析分离。
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２ 实验方法
２．１ 葡萄籽原花青素粗提方法 称取１０．０００ｇ经石油醚脱脂葡萄籽粉（４０目），用
体积分数７０％的乙醇溶液搅拌提取３次，合并提取液， 离心过滤，得澄清的滤液。滤液在４０℃以下减压浓缩， 经真空干燥，得葡萄籽原花青素粗提物。此样品用于静 态吸附及解吸性能试验。
＊ 基金项目：新疆维吾尔自治区重点科技攻关项目（２００１ＢＡ５０７Ａ０４－Ｐ０２）。 作者简介：朱靖蓉（１９７２～ ），女，新疆乌鲁木齐人，实验师，硕士研究生，研究方向为食品活性成分。
２００７ 年第 ４ 期
中国食物与营养 Food and Nutrition in China
Ｎｏ．４，２００７
葡萄籽原花青素的分离纯化及其抗氧化活性研究＊
朱靖蓉 １，王忠民 ２，李瑾瑜 １，马兴旺 ３
（１ 新疆农业大学食品科学学院，乌鲁木齐 ８３００５２；２ 新疆食品药品监督管理局，乌鲁木齐 ８３０００２； ３ 新疆农业科学院，乌鲁木齐 ８３００９１）
摘 要：本文以脱脂葡萄籽为原料从中提取原花青素，研究用大孔吸附树脂对原花青素分级纯化方法，以及纯 化的原花青素产品清除超氧阴离子自由基、亚油酸体系的抗氧化等方面的抗氧化活性。结果显示：ＡＤＳ－８ 大孔树脂 对葡萄籽原花青素具有较强的吸附能力，得到的产物纯度达 ９５％以上，是分离葡萄籽原花青素较理想的吸附剂； ２０％和 ４０％的乙醇原花青素洗脱液具有很强的清除 Ｏ２－·的能力，抑制邻苯三酚自氧化率分别达 ８８．３５％和６７．２％， 说明葡萄籽原花青素为抗自由基的有效活性成分；在亚油酸体系中，ＯＰＣ’ｓ 的抗氧化能力高于 ＶＣ 和 ＶＥ。
关键词：葡萄籽；原花青素；大孔吸附树脂；自由基
原花青素是迄今为止所发现的最有效的自由基清除 剂之一，它对近７０多种疾病具有直接或间接的预防治疗 作用，具有广泛的生化和药理活性，在医药、化妆品及 保健食品等领域具有广泛的用途［１］。原花青素广泛存在 于各种植物（如葡萄、银杏、白桦树、可可豆等）的 核、皮或种籽中，大多数原花青素产品从各种植物中提 取，但多数的原花青素含量比较低。目前普遍认为葡萄 籽是提取原花青素的较好来源［２，３］，但葡萄籽提取物是 多酚（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏ１）类黄酮，由单体（儿茶素、表儿茶 素等）、基于此单体的聚合物（原花青素 ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｌｎ）和其它酚类组成。这一组成分中生物 活性最强的部分是低聚（二，三聚体）原花青素，即 ＯＰＣｓ（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｐｒｏａｎｔｈｏ ｃｙａｎｉｄｉｔｎｓ）［４］。在葡萄籽提 取物中ＯＰＣｓ含量高低就成为产品质量的最关键指标。 葡萄籽粗提物中原花青素含量较低，需进一步分离纯 化。在各种分离方法中，由于近年来发展起来的大孔吸 附树脂吸附洗脱法具有选择性好、吸附容量大、再生处 理方便，及吸附迅速、解吸容易等优点，在天然产物工 业化提取分离中得到广泛应用。本文以葡萄籽为原料从 中提取原花青素，并选用大孔吸附树脂对自制的原花青 素进一步吸附、洗脱分离，进行纯化，就纯化后的原花 青素产品在不同体系中清除自由基的活性进行研究，探 索提取高纯度原花青素的方法，为进一步开发利用原花
过氧化值的测定采用硫氰酸铁法：取０．１ｍｌ亚油酸 乳化液，依次加入９．７ｍｌ ７５％的乙醇和０．１ｍｌ ３０％的硫 氰酸氨，再加入０．１ｍｌ ０．０２Ｍ溶解于３．５％盐酸的氯化亚 铁，快速混匀，反应３ ｍ ｉ ｎ 后测定５ ０ ０ ｎ ｍ 吸光度，以 Ａ５００ｎｍ表示亚油酸氧化程度，０ 时刻测定，以后每隔 ２４ｈ测定一次，扣除０时刻值即为ｔ时刻过氧化值。各样 品的抗氧化能力以１９２ｈ时的氧化程度按下式计算，以抑 制率（％）表示：
用体积分数１０％、２０％、４０％、５０％、７０％的乙醇
溶液进行解吸，流速２ＢＶ／ｈ ，洗脱体积３ Ｂ Ｖ。将洗脱 液真空浓缩，得到葡萄籽原花青素纯化物浓缩液。 ２．５ 研究葡萄籽原花青素清除自由基活性的方法 ２．５．１ 清除 Ｏ２－·自由基试验
在试管１中加入２．８ｍｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液、０．１ｍｌ水和０．１ｍｌ 的０．０１ ｍｏｌ ＨＣｌ，在试管２中加入２．８ｍｌ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ溶液、 ０．１ｍｌ ０．０１ｍｏｌＨＣｌ，在试管３中加入２．８ｍｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶 液、０．１ｍｌ水，在试管４中加入２．８ｍｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液，将试 管１～４、邻苯三酚溶液、２．４中提取原花青素溶液于２５℃ 保温２０ｍｉｎ。然后以试管１作为参比，取０．１ｍｌ原花青素 溶液加入到试管２ 中，迅速摇匀，４ ２ ０ ｎ ｍ处测量吸光值 Ａ１；取０．１ｍｌ邻苯三酚溶液加入到试管３中，迅速摇匀， 每隔３０ｓ测一次４２０ｎｍ处吸光值Ａ２；分别取０．１ｍｌ原花青 素溶液和０．１ｍ１邻苯三酚溶液加入到试管４中，迅速摇 匀，每隔３０ｓ测一次４２０ｎｍ处吸光值Ａ３。按下式计算各样 品对Ｏ２－·的清除率Ｉ（％）。
抑制率（％）＝（１－ 含抗氧化剂样品Ａ５００ｎｍ（ｔ＝１９２）－Ａ５００ｎｍ（ｔ＝０））×１００％
空白样品Ａ５００ｎ
－Ａ５００ ｍ（ｔ＝１９２）
ｎｍ（ｔ＝０
）
３ 结果与分析
３．１ 三种大孔吸附树脂对原花青素静态吸附及解吸性 能比较 由表１中吸附量看，ＡＢ－８、ＡＤＳ－８和Ｓ－８型树脂均对
原花青素具有相对较强的吸附能力。但从解吸效果来
Ｉ（％）＝（１－ Ａ ３ － Ａ １ ）×１００％ Ａ２
２．５．２ 原花青素对亚油酸体系抗氧化能力的检测—— 硫氰酸铁法（ＦＴＣ 法）
取１ｍｌ已溶解于无水乙醇的样品溶液，加入１ｍｌ含 ２．５１％（Ｖ／Ｖ）亚油酸的无水乙醇溶液，２ｍｌ ０．０５Ｍ、 ｐＨ７．０的磷酸盐缓冲液，１ｍｌ蒸馏水，密封后４０℃恒温避 光氧化，以乙醇代替抗氧化剂做空白对照。
能洗脱的原花青素。经ＡＤＳ－８大孔树脂层析分离，原花 青素的纯度可达９５％。 ３．３ 原花青素的梯度洗脱效果
从表２ 看，５ ０ ％的乙醇可以较完全地将吸附在 ＡＤＳ－８树脂上的原花青素解吸下来，这在工业生产 中是可行的。７０ ％的乙醇已经基本能够洗脱吸附于 树脂上的绝大部分固形物，可以用于树脂柱的初步 再生。这充分证明了树脂法分离原花青素时简单、 高效的特点。
朱靖蓉等：葡萄籽原花青素的分离纯化及其抗氧化活性研究
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２．２ 原花青素含量分析方法 采用盐酸—香草醛法［５，６］，以原花青素标准品作
标准曲线，计算样品中原花青素含量。 ２．３ 大孔树脂筛选 ２．３．１ 静态吸附量及解吸率的测定
准确称取吸附树脂２ｇ ，用少量乙醇湿润后，以蒸 馏水洗去乙醇，再吸干其表面水分后置于１５０ｍｌ三角瓶 中，加入４０ｍｌ原花青素溶液（１５ｍｇ／ｍｌ），置于水浴 摇床，３０ ℃，１ ２ ０ ｒ／ｍ ｉ ｎ振荡３６ｈ后过滤，再用１ ０ ０ ｍ ｌ ９５ ％乙醇洗脱树脂，分别测定滤液及洗脱液中原花青 素总量，计算树脂的吸附量及解吸率。
Ｃ／ＣＯ
０．１２ ０．１０ ０．０８ ０．０６ ０．０４ ０．０２ ０．００
０
１５．０ｍｇ／ｍｌ ５．８ｍｇ／ｍｌ
２
４
６
８
１０
上样体积（Ｂ Ｖ ）
图１ 不同浓度原花青素在ＡＤＳ－８树脂上的吸附透过曲线
３．２ ＡＤＳ－８ 树脂的解吸特性 用不同浓度的乙醇溶液梯度洗脱ＡＤＳ－８树脂吸附的