等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定1常灏，黄耀江，沈光涛中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081）E-mail：haobio@摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。

等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。

本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。

经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。

关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。

它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。

[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。

[3]由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。

[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。

现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。

我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。

目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。

[1]其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。

凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。

已有报道显示，将猪血浆采用适宜的稀释度稀释后，用1%或2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可将猪凝血酶原粗制品沉淀出来。

[2][4][5][6]在我国，牛血的来源也是比较丰富的，因此从牛血中提取凝血酶也具有一定的社会意义。

欲利用等电点沉淀法得到牛凝血酶的粗制品，需预先得知其等电点。

虽然已有文献报道，将牛血浆稀释10倍后，用2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可沉淀出牛凝血酶原[7]，但其等电点的准确值在文献中尚未见报道。

随着系统生物学和蛋白质组学的迅速发展，作为其主要的研究手段之一的电泳，应用范围越来越广泛和普遍。

等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF）电泳技术，凭借其高分辨率等优点，现已成为一种被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。

它不仅可以测定蛋白质的等电点，分离混合的蛋白质，而且与SDS-PAGE组成双向电泳后可大大提高分离蛋白质的能力。

因此，可以采用双向电泳的方法（第一向：IEF，第二向：SDS-PAGE），测定牛凝血酶的等电点。

根据凝胶过滤法的测定，牛凝血酶的相对分子质量为37 kDa，由两条多肽链通过一个二硫键相连，A链为5kD，B链为32kD。

[2]这样就可以在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中确定牛凝血酶的条带，从IEF中得知其等电点。

等电点测定后，使得采用等电点沉淀法获取牛凝血酶粗制品时纯度更高，有利于纯化操作和研究其功能，以及其它相关研究工作的进行。

2.等电聚焦基本原理1本课题得到学校“211工程”基金资助。

等电聚焦(Isoelectrofocusing, IEF)是1966年由瑞典科学家Harry Rilbe和Olov Vesterbery 建立的一种高分辨的蛋白质分离分析技术。

它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的不同在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离分析。

蛋白质是由不同数量和比例的L-α氨基酸组成的。

氨基酸侧链在不同的pH环境中带不同的电荷。

当pH>pI时，蛋白质带负电荷，在电场的作用下向正极移动；当pH<pI时，蛋白质带正电荷，在电场的作用下向负极移动；当pH=pI时，蛋白质所带的净电荷为零，在电场的作用下不发生移动。

蛋白质的等电点范围很宽，因此可以依据等电点来进行蛋白质的分离和分析。

在凝胶中放入载体两性电解质，通以直流电后即可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度。

当带电的蛋白质分子进入此体系时即移动并聚焦于相当其等电点pH的位置。

因此，本技术可依据等电点的不同将蛋白质分子分离，并且反之根据蛋白带pH在梯度中的位置测得该蛋白质的等电点。

构成凝胶介质pH梯度的载体两性电解质是由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构物和同系物组成的。

载体两性电解质在凝胶中形成pH梯度的时间约为30分钟到1小时。

当蛋白质在电场中迁移到它的等电点位置时，本身没有净电荷，电场不能使其移动。

如有扩散，带有载体两性电解质的凝胶介质会使其荷电，阳、阴极则将重新吸引它回到等电点位置，因此蛋白质只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带。

这种“浓缩”或称“聚焦”效应使等电聚焦的分辨率大大高于常规电泳，是一向电泳中分辨率最高的电泳技术。

3.材料和方法3.1实验用品3.1.1样品及其处理胰蛋白酶（华美生物工程公司）、牛凝血酶（美国sigma分装，24.5U/mg，1000U）。

称取胰蛋白酶20mg，用重蒸水定容至10ml，制备成2mg/mL的胰蛋白酶样品。

根据牛凝血酶的比活力和分装的活力单位计算，可知酶的含量约为40mg，用20ml重蒸水将其溶解为2mg/ml的样品，分装成20份，于-20℃保存。

胰蛋白酶和牛凝血酶的溶解性都很好，溶解样品时无需再加入助溶剂。

3.1.2标准品及其处理等电点标准（英国Amersham Biosciences，pH3-10，235µg/vial），低分子量蛋白标准（英国Amersham Biosciences，分子量14.4kDa~97kDa，575µg/vial；中科院上海生化所，分子量14.4kDa~97.4kDa，40µg/种蛋白质）。

用100µL重蒸水溶解等电点标准，分装成10份，于-20℃保存，每次的上样量为10µL （3.25mg/ml）。

低分子量蛋白标准按使用说明书中的方法处理，分装后保存于-20℃。

3.1.3试剂乙醇（95%）、甲醇、冰醋酸、盐酸（6mol/L）、磷酸（1mol/L）、氢氧化钠（0.5mol/L，1mol/L）、磺基水杨酸、三氯乙酸、甘油、巯基乙醇。

（以上试剂除三氯乙酸为CP级、巯基乙醇为香港生产外，其它均系国产AR级。

）丙烯酰胺（美国sigma分装，电泳级，纯度：>99%）、甲叉双丙烯酰胺（瑞士Fluka）、过硫酸铵（华美生物工程公司）、TEMED（中科院上海生化所东风生化技术公司）、载体两性电解质（pH3~9.5，进口分装；pH5~7，北京科百奥生物科技有限公司）、考马斯亮蓝R250（瑞士Fluka分装）、甘氨酸（产地：上海，纯度：>99%），Tris Base（Promega Corporation）、SDS（sigma分装）、琼脂糖（华美生物工程公司）、溴酚蓝（北京化工厂）。

欲将干胶制作在玻璃板上，还要用到亲和硅烷和剥离硅烷。

3.1.4主要仪器和设备DYY-12C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、DYCP-36型等电聚焦电泳槽（北京市六一仪器厂）、DYCZ-24D迷你垂直型电泳槽（北京市六一仪器厂）、层析实验冷柜（或恒温循环器）、酸度离子计（pH211）、脱色摇床、电子称、恒温培养箱、移液器。

3.1.5溶液的配制30%①凝胶单体贮液：等电聚焦电泳用C=3%的单体贮液：丙烯酰胺14.55g，甲叉双丙烯酰胺0.45g，重蒸水溶解，定容至50ml（4℃棕色瓶中，可保存两周）。

SDS-PAGE用C=2.6%的单体贮液：丙烯酰胺14.61g，甲叉双丙烯酰胺0.39g，重蒸水溶解，定容至50ml（4℃棕色瓶中，可保存两周）。

10%②SDS贮液：2.5gSDS溶于25ml重蒸水中（配制时需水浴加热以促溶解），室温保存。

20%③SDS贮液：5.0gSDS溶于25ml重蒸水中（配制时需水浴加热以促溶解），室温保存。

④电极液：pH3～9.5等电聚焦电泳电极液：阳极1mol/L H3PO4；阴极1mol/L NaOH。

pH5～7等电聚焦电极液：阳极0.5mol/L冰醋酸；阴极0.5mol/L NaOH。

SDS-PAGE电极液：每次用量以500ml计算，称取Tris Base 1.514g，甘氨酸7.207g，10%SDS贮液5ml,定容至500ml（pH 8.3，不用调pH值）。

SDS⑤-PAGE分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl 缓冲液）：称取Tris Base 18.171g，用6 mol/L 盐酸调pH值至8.9后，用重蒸水定容至100ml（4℃保存）。

SDS⑥-PAGE浓缩胶缓冲液（1.0mol/L Tris-HCl 缓冲液）：称取Tris Base 12.114g，用6 mol/L 盐酸调pH值至6.8后，用重蒸水定容至100ml（4℃保存）。

SDS⑦-PAGE上样缓冲液：称取SDS 1g，甘油5ml，巯基乙醇2.5ml，溴酚蓝2滴，浓缩胶缓冲液25ml，用重蒸水定容至50ml（4℃保存）。

⑧平衡液：巯基乙醇5ml，浓缩胶缓冲液6.25ml，20%SDS贮液11.5ml，甘油10ml，定容至100ml。

⑨固定液：35%甲醇（V/V），10%三氯乙酸（W/V），3.5%磺基水杨酸（W/V）。

⑩染色液：35%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V），0.1%考马斯亮蓝R250（W/V），溶解后用滤纸过滤备用。

○11脱色液：25%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V）。

○12保存液：10%甘油（V/V），25%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V）。

○1310%过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶解于1ml重蒸水中，现用现配。

3.2方法和步骤通过3.0～9.5pH梯度胰蛋白酶等电点的测定，建立等电聚焦电泳的方法。

利用已建立的方法，经3.0～9.5pH梯度的测定，牛凝血酶等电点的范围在5～7，然后在5～7pH梯度的范围准确测定牛凝血酶的等电点。

因本实验中经5～7pH梯度的范围等电聚焦电泳后，牛凝血酶产生了13条带，故采用了双向电泳的方法（第二向：SDS-PAGE），从而以牛凝血酶相对分子质量为依据确定其条带和等电点。

3.2.1等电聚焦凝胶的配制和灌胶①凝胶的配制：按照表1-1的比例配制凝胶。

本实验采用T=5%的凝胶，每次灌胶时配制10ml 即可。

表1-1 等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶的配制溶液成分体积30%凝胶贮液/ml 1.7重蒸水/ml 7.675两性电解质/ml 0.625TEMED/µL 10 10%过硫酸铵/µL 25表1-2 SDS-PAGE凝胶的配制溶液成分分离胶浓缩胶T值7.5% 5% 30%凝胶贮液/ml 2.5 0.83 重蒸水/ml 4.8 3.4 分离胶缓冲液/ml 2.5 —浓缩胶缓冲液/ml—0.6310%SDS/µL 100 50 TEMED/µL 50 25 10%过硫酸铵/µL50 25 总体积/ml 10 5②灌胶：将玻璃板洗净晾干。