方法
反相液相色谱（PR-HPLC） 免疫沉淀 固相金属亲和色谱 金属氧化物/氢氧化物亲和色谱 离子交换和等电聚焦
免疫沉淀
原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞 内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用 被保留了下来
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X 在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来
么每一个被分离的肽段相应的活度计数就表明这一组 分中磷酸肽的相对量，如果已知所用放射性标记物的 比活，就能容易算出磷酸肽的绝对量 放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同 时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态的变化 肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利检测 和分析低丰度磷酸肽
1、磷酸肽的分离和富集
免疫沉淀物
固相金属亲和色谱 Immobilized metal affinity chromatography, IMAC IMAC柱：金属离子、螯合剂、填料 原理：带正电的金属离子，如Fe3+、Ca3+、Cu2+ 可以与带负电的磷酸集团产生静电交互作用而 结合，这种结合能力受pH值、离子强度和溶液 有机相的影响，在高pH或磷酸盐存在的缓冲液 中，金属离子与磷酸基团间的结合被破环，磷 酸肽被释放出来
蛋白质磷酸化研究有三个主要目的
(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白 质在体内的磷酸化氨基酸残基定位
(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶 (3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋 白质组学研究的关键技术之一
细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的 表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部 分的分析也很困难, 一般一个发生磷酸化的蛋白 质其磷酸化的部分仅占其总量的10%
三、磷酸化蛋白质的检测
32P放射性标记法 抗体免疫印迹检测法
1、32P放射性标记法
32 P 放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测 方法
放射性32P标记的ATP处理细胞，使32P掺入磷酸化 蛋白质
培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的 细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，用不含磷酸盐的 标记培养液替换原来的细胞培养液，并加入32P标 记磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激 酶利用被放射标记的ATP使底物磷酸化
已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗 体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，磷酸化丝 氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有 空间障碍,所以抗体的结合力较差
免疫印迹法与免疫沉淀相结合,可以在电泳之前先富集 目的蛋白质,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋 白质,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高,抗磷酸酪氨 酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验
样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）
制备型2D胶电泳
分析型2D胶电泳
考马斯亮蓝染色
转印到膜
磷酸氨基酸抗体免疫检测—得到磷酸化蛋白质
图谱比较
找出相应的磷酸化蛋白质
染色—得到全部蛋白质点
磷酸化蛋白质鉴定
四、蛋白质磷酸化位点的分析
1、磷酸肽的分离和富集
分离浓缩分析物，提高信噪比 如果磷酸肽被放射性标记，并具有相同的比活度，那
蛋白质翻译后修饰
蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的 作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为 完善，调节更为精细，作用更为专一 N-端fMet或Met的切除 二硫键的形成 化学修饰 剪切
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫 应答和应激反应等生理过程起着重要作用
磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收 缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过 程
化的相对化学计量 (3)电泳和TCL的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性
的相对状态
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式 的质谱分析中信号受到抑制，在MALDI源的质 谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化 肽段的信号强度要低很多
磷酰键较肽键容易断裂，使磷酸化蛋白比非磷 酸化蛋白鉴定要困难的多
蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移 到底物蛋白质氨基酸残基上的过程
磷酸化类型
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化 精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸
和谷氨酸的酰化 丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化
=1800：200：1
被磷酸化修饰的蛋白
改变所带的电荷 改变催化基团的性质 改变蛋白质的构象 改变蛋白质的亚细胞分步 蛋白质功能变化的多样性
糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的 复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作 用
脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常 关键的作用
组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关
第一节 蛋白质翻译后修饰的鉴定
一、生物体内的蛋白质磷酸化修饰及其功能
蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团 从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生 物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的 传递过程中占有极其重要的地位
局限性
磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质 不能标记组织样本 放射性污染
2、抗体免疫印迹检测法
通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反 应(Western blotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用 的方法
在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨 酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化
μLC－ESI-MS
IMAC
二、磷酸化蛋白质分析的概述
双相磷酸多肽谱图 2D—PP
多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一 块板上进行薄层色谱(TCL)为第二相，分离得到的 磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测
此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷 酸化状态的重要信息
(1)磷酸化位点的最大数目 (2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸
磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化的肽段 很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中Biblioteka 二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸氨基酸 分析
体外 pmol 32p蛋白标记
蛋白质分离 蛋白酶切 2DPP作图
体内 fmol 32p细胞标记
相关分析
蛋白酶切 2DPP作图
μHPLC
μLC－ESI-MS或 MALDI-MS