—、样品制备1、取样（大约lx cells ）,离心弃上清，以PBS 洗两遍，逐滴加入1 ml 70%的 冷乙醇固定细胞，-20°C 冻存过夜。

分析时，离心弃上清，以PBS 洗两遍，加入 100|j 啲Rnase （GenScript 试剂A ）, 37°C 水浴30min,然后再加入400』的PI 染 液（GenScript 试剂B ）,在4°C 避光条件下孵ff30min 后即可上FCM 检测。

每个样品至少获取2xl04cells, 二、上流式测细胞1」、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属扌当板；取出鞘液桶， 倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS 或FACSFLow ）,拧紧鞘液桶盖，安上金属扌当板，保证管路畅通无扭曲。

检查废液 桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液） 向废液桶中倒入400ml 浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。

确实盖紧桶盖, 检查所有管路是否妥善安責。

1.2、 依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass 变Ac putput ）、变压 器电源，稳定5分钟。

将FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应 是STANDBYo 如果需要打印，打开打印机电源。

打开电脑（密码：BDIS ）,等待 屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。

1.3、 将压力阀責于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。

若滤器管路中有气泡，打开连接 头，挤出鞘液，以排除气泡。

关闭液流抽屉。

执行仪器PRIME 功能一次，以排除 Flowce 呻的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流岀）。

结束后自动STANDBY, 5分钟后即可进行试验。

2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化，选散点图标，打开，Plot type 选择Acq-analysis, X 参数和丫参数分别取FSC-H 、SSC-H （选择散点图主要是确定 所需细胞的细胞群）。

选择单参数图标，打开，Plot type 选择Acq-onalysis, X 参数选择FL2-H 1024（此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光，本 实验使用PI 作为荧光染料，故选择FL2-H ）Y ParameterPlot Source ：|<Select File...X Parameter Mie ：| Acquisition2.2、从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer （快捷键：歸+ B）进行电脑和仪器的连机。

此时出现Parameter description对话框，选择BD files,设責文件存放的位責｛在Acquire指令栏中，选择Parameter Description, 以决定文件存储位H（folder）,文件名称（file）,样品代号以及各种参数的标记（panel）,即安排tubel, 2, 3…的检测参数。

一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \XXX 和DNA文件夹中。

文件根据日期命名。

｝同时将岀现的Acquisiton Control^话框,将其移至合适位責。

2.3、从Cytometer 指令栏中，开启Detectors/Amps , Threshold , Compensation, Status等四个对话框，并将他们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取文件。

也可以用&+1, 2, 3, 4获得此四个对话框。

2.4、在Detectors/Amps （可通过调整电压，是FSC、SSC放大或者缩小）对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifiermode）:线性模式Lin或对数模式Log。

一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC 和SSC多以线性模式Lin测量，且DDMParam选择FL2,而FL1, FL2, FL3皆以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC, SSC, FL1, FL2, FL3皆以Lin进行测量，且DDMParam选择FL2;分析血小板表型时，FSC, SSC, FL1, FL2, FL3皆以Log进行测量。

在Threshold对话框中选择适当的参数设定阀值，并调整Threshold的高低, 以减少噪音信号（细胞碎片）。

一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H O Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。

在Compensation对话框中，根据所用的调整补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。

•在Status对话框中，LaserPower:正常值-Run/Reody为14.7mW, Standby为5mW; LaserCurrent:正常值为6Amps 左右。

2.5、通过预设的获取模式文件进行样品分析。

从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings,在其对话框中选择Open以调岀以前存储的相同实验的仪器设定，按Set ,Done确定。

2.6、加样:混匀、上样、按run （放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN, 流速可在HIGH或LOW±）............... ・・・・・・・・ , ・・・・・'・ I—■. 口心二口》心心心心三三门心》1二Acquisition Control三三送三门圧三三三三三T三门亦2.6.1.T具板中选择多角形区隔工具，FSC/SSC散点图上，R1区域的界定，我们将以此区域来圈选本次测量的细胞。

（如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates - Region list,以鼠标点选R1,再按Delete键删除R1区在单参数的图上，gote位置选择“G1二R1”使在单参数的图上显示的是R1区域的细胞的荧光。

2.6.2选择“acquire” ―― “counters”打开计数器，本实验计数10000个细胞为准。

测量期间，几十秒后（待电压稳定），点击Abort,去掉勾选setup 开始测量，如需暂停请按a stndby\ 可按run继续。

三.样品分析使用Modfit 软件分析数据。

打开file--选择需要分析的文件。

r4 * Wit '・z "• I -nh Mr«»•in?PM ITtorqueVXOKMIUl.anUUidI^JUL1 1 II 11 1 乡11 N店1Ml帕I弊艸穴 EWE ov4«i-ro<x>2rut4 Str^flkaiftS S2fih»|U*<y 3y Z KS | 域。

删除R1区域后，可用绘图工具板，重画Rio ）■Choose Parameter For Analysis=P1：FSC-HP2: PIP3:FL1-H LOGP4rFL2-HF'5:FL2-A 391P6:FL2-W吒Choose the parameter you want to anal^e.Define gate 1X: FSC-H Y: SSC-H 点击 OK Define gate 1 X: FL2-W Y: FL2-A点击 OK»te Name EatTlX Parameter■ -1-• f l 」c ■・<J ・" — 23^5 FH-HPIFLI-H LOG FL2-HFL" FL2-WP1 FSC-H P2 PIP3 Ft I-HLOG P4： FL2-HP5 FLU*P6FLZ-WkY Parameter以上分别选择合适的范围一个是对细胞的处理一个是对荧光的处理点击Mode——OKIWIPUU I V Ul — C4II UIUI CM\S□M HFitE]ReprtII 9 I 100% ▼] Bre^t FileSc^leMod • • RangeSaveFrin J | HelpJ点击Fiti-iie tzflir view Analysis IOOIS HeipFi lc o no lyzed, wanq xi u yun.00 1 Date onolyzed. 8-Jul - 2009 Modal ： 2M0A_DSD_ASF Analysis t ypo ： Monuel □noly^ioDiploid ： 97.50 %Dip G 1 : 9 8^48 % 合t 46 02 Dip G2: 1 50 % 合t 9Z.O3 DIPS: O 02聪 GZ/G 1 : 2 00 %CY: 2.36Ancuploid 1 : 2.50 %Anl G1 : 45.58 % at 50.39An1 G2： 0.42 邓 at 1 01.51Anl S ： 54.00 93 G2/G1 : 2.01 玄CV ： 0.45 DI ： 1 .10 Total Aneuploid S-Pha^e ： 54.00 霜 Total S-Phas ：e ： 1 .37 %Total B A D.： □ o 1 %Apoptosis ： O 03 % Mewn ： 34.87Al I cycle c=vcn*t>； 19704Cycle even to per thonncl: 349 RCS ： 5.693|| 口 X|nn|F前| | Auto | | Scale | Mod | R<ange | y I EIDiog ，| RepfCS-aveFitModFit LT - untitJed S100%KreasfDebr isApoptosis Dip G1 Dip 02 Dip SAn1 G1 An1 G2 An1 SDebris ： 0 21 %Aggrciaatc^; 0.00 % t~1od<? I cd eve nU; 1 97 5 2L2-W-H_2-W四、流式细胞仪使用完毕后的维护从File 中选择Quit 退出软件，选择Don 5 tSave 至苹果屏幕。

将4ml1： 10稀释的次氯酸钠溶液（10%稀释至1% ）用滤纸过滤后作样品，将样品責于旁位(vacuum is on),以外管吸去约1ml,在将样品架責于中位ModEil 分枷11 iTlfp I li j I it 11 iTTT] ii 11| 020 40 60 80 100 120Channels (FL2-A-FL2-Area)File analyzed: qq.OO3Date analyzed: 3-Jun-2009 Model: lDAOA^DSFAnalysis type: Manual analysis Diploid: 100.00 %Dip Gl: 63.02 % at 44.61 Dip G2: 1&55 % at 86.71 DipS: 18.44% G2/G1: 1.94 %CV: 6」2Total S-Phase: 18.44 % Total 5.45 %Apoptosis: 15.11 % Mean: 19.05 Debris: 6.04 % Aggregates: 1.72 % Modeled events: 2775 All cycle events: 2166Cycle events per channel: 50 RCS: 6.238(vacuum is off),再HIGH RUN 10 分钟(内管吸去2ml) 0改用三蒸水6-10ml作样品，同上处理，但是使用三蒸水的量一定比次氯酸钠的时间更长以清洗掉次氯酸钠残夜。