动物细胞培养及无血清培养研究进展摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。

其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。

本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。

为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。

关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基1 引言组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。

这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。

近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。

然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。

因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。

2动物细胞培养动物细胞培养方式包括原代和传代培养。

培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。

2.1动物细胞培养的基本概念细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。

从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。

原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。

原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。

传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。

2.2动物细胞培养技术的内容2.2.1培养的环境要求1）无菌无毒：无菌无毒的操作环境是保证动物细胞体外培养成功的前提。

体外培养细胞面临着被微生物感染或受自身代谢物质影响的难题，因此，在进行体外细胞培养时，要及时清除细胞产生的代谢废物，确保为体外培养的细胞提供一个无菌无毒的生存环境。

2）气体：气体主要是O2和CO2，O2可以给细胞提供能量，而CO2不仅是细胞增殖所需的物质，也是其自身的代谢产物，此外，CO2还有着调节培养基pH 的作用。

3）温度：适宜的温度能够维持细胞持续旺盛生长，若温度超出适宜温度范围，不仅会影响到细胞的正常代谢，损伤细胞，甚至会使其致死。

4）缓冲环境：缓冲环境的作用是为细胞提供一个酸碱度在培养细胞生理范围内的培养液，提供水分和无机盐，维持细胞的正常代谢。

5）培养基：培养基分为天然培养基和合成培养基两种，它是细胞生长繁殖的直接环境，为细胞提供所需的营养。

天然培养基是从动物体液或组织中分离提取获得的。

血浆、血清以及淋巴液等物质都可作为天然培养基。

动物细胞培养主要用的是合成培养基。

合成培养基含细胞生长所需的无机盐、糖类、维生素、氨基酸等基本物质，有特殊要求的还会添加适量血清。

2.2.2培养方式1）贴壁培养：对于那些具有贴壁依赖性的细胞一般使用贴壁培养的方式。

一般这样的细胞需贴附于不起化学作用的物质的表面生长，最终在表面生长至单层，当整个平面被铺满时，细胞会出现接触抑制的现象。

2）悬浮培养：悬浮适应细胞、肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞不需要生长的支撑面，细胞可悬浮于液体培养基，并大量增殖。

因此，悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式。

尽管，动物细胞培养当中存在着各式各样的困难，科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平，扩大研究范围，因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。

3）固定化培养：无论是贴壁依赖性细胞还是非贴壁依赖性细胞都可用固定化培养方式进行体外细胞培养。

固定化培养属于包埋培养方式，目前已有的固定化培养方式包括微载体培养、中空纤维培养以及微囊发培养三种方式。

固定化培养不仅剪切力较低，传递效果较好，而且还易于收集并分离纯化细胞产物。

用此种方式培养的细胞也具有较强的抗污能力，细胞生长较为集中，生长密度也高。

2.2.3原代培养和传代培养将动物的器官或组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，分散成单个细胞，制成细胞悬液，放入培养瓶内，放在适宜的条件下培养，一般细胞繁殖1~10 代，就发生接触抑制，这种培养叫原代培养。

原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，还要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理后，再分瓶培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。

传代培养一般传至10~50代就不能再分裂了，这时细胞核内遗传物质未发生变化，形成的细胞群叫细胞株。

传代培养过程中有个别细胞传至50代以后，由于遗传物质改变，失去接触抑制，成为无限增殖的癌细胞形成的细胞群，叫细胞系。

3无血清培养3.1血清血清是一种很好的营养物质，绝大多数细胞在含有胎牛或新生牛血清的培养基中生长得最好，但它来源比较难，而且它的成分不确定，使得生长过程不易检测和控制。

任何血清使用前必须经过鉴定，只有无菌、无内毒素、无溶血或低溶血、蛋白质以及营养素达到一定标准以上的血清才能使用。

有的细胞，能在无血清培养基中生长，用渐适法可使本来需要血清的细胞适应于在无血清培养基中生长。

3.2无血清培养1976 年，Sato等发现 GH3细胞株能在添加了少量生长因子的无血清培养基中维持生长。

此后，无血清培养技术得到了逐渐完善发展。

21 世纪后，随着生命科学研究的不断深入和生物医药产业快速发展，细胞有血清培养表现出严重的不足，因而动物细胞的无血清培养技术日益引起同行专家的高度关注。

2003年4月5日至7日，Vera Baumans 等组织召开了题为“改进体外培养技术方法，替换胎牛血清”的会议，并号召在全球范围内减少 FBS 的使用。

3.2.1特点分类自从第一次使用无血清细胞培养获得成功之后，至今无血清培养基的研制与应用大约经历了三个不同的阶段。

第一代无血清培养基是一类用各种可替代血清功能的生物材料配制成的细胞培养基。

由于这类培养基含有大量动物来源蛋白和不明的添加成分，许多厂商基于生物药物安全和药品开发报批考虑，致力于开发第二代无血清培养基。

这类培养基中完全无动物来源组分，对于从事生物药物开发生产的厂家来说，既加快了药品申报的进程又保证了药物的使用安全和产品质量，同时也在一定程度上降低了成本，提高了效率，在生物医药的研发和生产领域深受欢迎。

近几年来，由于生命科学研究和基因工程药物开发的需要，第三代化学组分限定培养基也已被开发出来，并在市场上获得了很好地效果。

这类完全不含血清、无蛋白或蛋白含量极低的培养基亦被称之为双无培养基。

与过去的培养基相比，具有无可比拟的优越性，成分明确，增加了实验结果的科学性和可靠性；性能一致，使得细胞培养和试验结果有更好的重复性。

无蛋白成分，有利于纯化和下游加工;；最大程度上减少了细胞生长和表达的不利因素，使得生长更好和产量更高；可以从根本上消除了血清源性污染等。

3.2.2无血清培养基的构成无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的补充因子两部分组成。

基础培养基通常是按一定比例的葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素等组合而成的合成培养基，它是维持组织或细胞生长代谢必不可少的物质。

而补充因子，替代了传统培养基中的血清，既能有效避免血清带来的诸多问题，也能满足动物细胞培养的要求。

补充因子根据需求的必要性一般分为必需补充因子和特殊补充因子。

必需补充因子是所有细胞株在无血清培养基中生长时都需要的，包括胰岛素和转铁蛋白等。

特殊补充因子一般含有激素、生长因子微量元素、贴壁和铺展因子、维生素和酶抑制剂等。

3.2.3无血清培养基的应用无血清培养基最初主要用于生物制品和生物药物的研制与生产，随着近年来生物技术和生物医药产业的蓬勃发展，无血清培养基已广泛地应用于细胞生物学、药理学、生命科学、肿瘤学和细胞工程等各个领域。

其应用价值主要表现在以下几个方面:1）研究细胞的分化条件: 许多在含血清的培养基中不能保持原代细胞分化现象的细胞系，在无血清培养基中成功地保留着分化能力和分化现象。

2）用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究。

3）用于从多种细胞混杂的培养中选择目的细胞，通过对无血清培养基中的某些成分的取舍，可抑制原代组织培养物中非目的细胞的过度生长，达到选择目的细胞的目的。

3.3研究水平与应用状况3.3.1无血清培养基的设计优化在无血清培养基的具体应用中，可以通过选择或优化适当的基础培养基和补充因子的种类及用量，使其更符合培养要求。

例如，细胞工程的常用细胞CHO往往是利用DMEM ∶F12∶RPMI 1640（2：2：2）或者EX－CELLTM320作为基础培养基，而Vero的常用基础培养基则为M199、DMEM或F12等。

如必需补充因子中的胰岛素，因其费用昂贵，目前有研究报道可利用金精三羧酸作为胰岛素替代物培养CHO细胞，细胞的生长正常，并极大降低了成本。

Rourou等在研究Vero细胞无血清培养基时认为，维生素C和柠檬酸铁混合使用可以替代转铁蛋白，这为寻求转铁蛋白替代品提供了参考。

3.3.2无血清培养应用状况目前已有越来越多的药用蛋白在 CHO 细胞中获得了高效表达，其中部分药物已投放市场，例如 EPO、t － PA、EGF、GCSF 等多种重组蛋白和细胞因子。

常用的 CHO 细胞包括原始 CHO 细胞株和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型( DHFR－ ) CHO 突变株。

CHO 细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系，与其他表达系统相比，CHO 表达系统具有准确的转录后修饰功能、贴壁悬浮兼性生长、较高的耐受剪切力和渗透压能力、产物胞外分泌功能且很少分泌自身的内源蛋白以及适于高密度培养等多方面的优点。

近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基( SFM) 。

但 SFM 往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。

有研究者尝试将类胰岛素生长因子 IGF 基因和转铁蛋白基因转入 CHO 细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级 CHO”，无需在培养基中添加转铁蛋白和胰岛素，细胞可在 SFM 中生长良好。

Gaurav Backliwal 等用编码细胞周期调节因子 p18、p21 及碱性成纤维细胞生长因子( aFGF) 的基因序列对表达载体进行优化，可以大大提高载体的表达能力。

而且，他们在培养液中添加适量的丙戊酸使得 HEK293E 细胞在无血清培养基中的最高生长浓度为 8 × 106 cells / ml，重组蛋白的表达水平达到1g / L 以上。

3.3.3大规模培养20 世纪 50 年代后，以疫苗为主的生物制品生产迅速扩大，细胞转瓶培养成为细胞生产的主要方式。