B) 成相聚合物的浓度

聚合物分相的最低浓度为临界点，系线长度为零，此时分 配系数为1，即组分均匀的分配于上下相。 随着成相聚合物（聚合物/盐混合物）的总浓度增大，系 统远离临界点，系线长度增加，两相性质(疏水性等) 差别 增大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1)， 即大于1或小于1。 因此，成相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质越容易 分配于其中的某一相。

pH微小的变化，有时会使蛋白质的分配系数发生巨大的
改变（改变2~3个数量级）。
(4) 温度的影响

分配系数对温度的变化不敏感
成相聚合物对蛋白质有稳定化作用，所以室温操作活
性收率依然很高，且室温时粘度较冷却时(4 ℃) 低，有助 于相的分离并节省了能源开支。
四、双水相萃取技术的应用
主要应用于胞内酶的提取和精制
① 盐的种类
溶菌酶
卵蛋白
② 盐的浓度
影响蛋白质的表面疏水性，扰乱双水相系统，改 变各相中成相物质的组成和相体积比。 例如，PEG/磷酸盐体系

PEG、磷酸盐浓度及Cl-在上下相中的分 配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变， 这种相组成即相性质的改变直接影响蛋 白质的分配系数。

离子强度对不同蛋白质的影响程度不同。
将含有反胶团（W0=3~30）的有机溶液与蛋白质固 体粉末一起搅拌，使蛋白质进入反胶团中。
（六）反胶团萃取的原理
反胶团萃取的特点
影响反胶团萃取的生物分子的主要因素
(1) 水相pH值的影响
(2) 水相离子强度的影响
这两方面的效应都会使蛋白质分子的溶解性下降，甚至 使已溶解的蛋白质从反胶团中反萃取出来。
传统胞内酶的提取： 细胞破碎、离心去除细胞碎片、提取。
存在问题： 能耗大；
细胞碎片尺寸变化，固-液分离困难；
产品活性和功能对pH值、温度和离子强度等敏感； 大部分蛋白质亲水性强，在有机溶剂中溶解度低，且易变 性，传统的溶剂萃取法不适合。
双水相萃取的工艺
（一）目的物的萃取
（二）PEG的循环 （三）无机盐的循环
蛋白酶的收率高于60 %，蛋白酶 的分离系数高达15. 1，比活率为 原发酵液的1. 5 倍。
应用实例2：
提取抗生素和分离生物粒子
萃取丙酰螺旋霉素

双水相体系：PEG/ Na2HPO4
最佳萃取条件：
pH= 8. 0～8. 5 PEG 2000 (14 %) Na2HPO4 (18 %)


(2) 盐的种类和浓度

盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映 在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。
① 盐的种类
在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数， 不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不同 的相间电位。 由于各相要保持电中性，使得带电生物大分子（蛋 白质、核酸）分别向两相移动分配。
双水相的选择原则：
必须有利于目的物的萃取和分离，同时又要兼顾高聚物 的物理性质。
二、双水相萃取相图（ATPS）
双节线 ：
双节线以下的区域为均相区，以上的区域为两相区。 系线：连接双节线上两点的直线。

两相区 系线
杠杆规则：在同一条系线上的各点分 成的两相组成相同，体积比不同。其 体积比服从杠杆规则：
高聚物/高聚物 体系
聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran, Dx)
聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇
甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖
高聚物/无机盐 体系 PEG/磷酸钾(KPi)
PEG相对分子质量 Dextran相对分子质量
生物分子分配于 富含PEG的上相
生物分子分配于 富含Dextran的下相
分配系数
分配系数
A) 成相聚合物分子量的影响 PEG/Dextran双水相体系：
希望上相获得较高的蛋白质收 率，降低PEG聚合物的平均分 子量。 若希望在下相获得较高的蛋白 质收率，则应增加PEG聚合物 的平均分子量。
PEG/磷酸铵
PEG/硫酸钠
双水相萃取
双水相系统 (aqueous two-phase system, ATPS)
PEG = 聚乙二醇 (polyethylene glycol)
Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖(dextran)
一、双水相分离理论
双水相萃取的原理
生物物质在双水相体系中的选择性分配，当物质进入 双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力（如 疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、 下相中的浓度不同，即分配系数不同。
两步双水相萃取工艺
（一）目的物的萃取
2、若细胞匀浆液中的目标产物的分配系数较小，则可 采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。
三步双水相萃取酶的流程示意图
（二）PEG循环
在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循 环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化 学试剂，降低成本。
PEG的回收有三种方法： ① 加入盐使目标产物转入富盐相，从而回收PEG ② 将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去PEG，再洗 出蛋白质。 ③ 超滤
(2) 反胶团萃取基本概念
反胶团 (Reversed micelle)
两性表面活性剂在非极性有机溶剂中，当其浓度超过某 临界值时，表面活性剂的亲水性基团便会自发地向内聚集而 成，内含微小水滴的，微米或纳米级的聚合型胶体。 它是一种自我组织和排列而成的，热力学稳定的有序构 造。
在反胶团中，表面活性剂的非极性基团在外与非极 性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个
(3) 助表面活性剂的影响
(4) 溶剂体系的影响
溶剂的性质（尤其是极性）对反胶团的形成和 胶团大小都有影响。
蛋白质的溶解
蛋白质向非极性溶剂中反胶团的纳米级水池的 溶解，有四种机理： (1) 水壳模型； (2) 蛋白质中的亲脂部分直接与非 极性溶剂的碳氢化合物接触； (3) 蛋白质被吸附在微胶团的“内 壁”上； (4) 蛋白质被几个微胶团所溶解， 微胶团的非极性尾端与蛋白质 的亲脂部分直接作用。
Chapter 3 萃取分离
双水相萃取

发展历史 世纪60年代,从1956 年瑞典伦德大学Albertsson 发
始于20
现双水相体系
1979
年德国GBF 的Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于
生物产品分离

国内自20世纪80 年代起也开展了双水相萃取技术研究。
双水相萃取？
利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差 异来进行萃取的方法。
小试收率达69. 2 % 。 （乙酸丁酯萃取工艺的收率为53. 4 %）
作业：
（1）名词解释：聚合物的不相容性；相图。 （2）双水相体系的是怎样形成的？其组成是什么？ （3）影响双水相萃取的因素有哪些？ （4）双水相萃取技术有什么优越性？ （5）设计一个PEG/磷酸盐的双水相体系，并从番木瓜 中初步萃取木瓜蛋白酶。
(2) 一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子， 当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。 向水相中加入溶于水的高分子化合物，可以形成密度不同 的两相（或多相），轻相富含某一种高分子化合物；重相富含 盐类或另一种高分子化合物。因两相均含有较多的水，所以称 之为双水相。
常见的双水相体系
(1) 反胶团的临界胶团浓度：
表面活性剂在非极性溶剂相中能形成反胶团的最小浓
度。
(2) 反胶团的含水率 W0
W0用水和表面活性剂的摩尔浓度之比来定义，即

反胶团萃取的可能机理
2、反胶团的制备
（1）注入法： 将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂 的非极性有机溶剂中，然后进行搅拌直到形成透明的溶 液为止。 （2）相转移法： 把含有表面活性剂的有机相和含有蛋白质的水相接 触，在缓慢搅拌下，一部分蛋白质慢慢转入有机相。 （3）溶解法：
双水相的形成
将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物 浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就 是双水相体系。
这种含有不同聚合物分子的溶液发生分相的现象叫聚合
物的不相容性。
3.6.1 双水相萃取
形成原因：
(1) 当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对 分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增 加相比占主导地位，
（一）目的物的萃取
1、若目标产物在上相中的分配系数足够大，则细胞匀
浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺 获得较高的纯化倍数。

一步双水相萃取：
把生物材料悬浮液和双水相系统混合后，其中下 相含有大多数杂质，而上相含目标产物。

两步双水相萃取： 把一步萃取体系中的上相分离出来后，再加入盐 使其形成新的双水相体系，则富含PEG的上相得到回 收，同时，含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到 分离目标。
利用这一特点，通过调节双水相系 统的盐浓度，可有效地萃取分离不同的 蛋白质。
(3) 体系pH值的影响

pH影响蛋白质中可解离基团的离解度，从而改变蛋白质
所带电荷和分配系数。

pH还影响系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，影响H2PO4和HPO42-之间的比例，影响相间电位差U2-U1，从而影 响分系数。
3.6.2 反胶团萃取
(1) 反胶团萃取特点
反胶团萃取技术在分离生物大分子（特别是蛋白
质）上，有突出的优点：
（1）萃取率和反萃取率高，且具有选择性； （2）分离、浓缩可同时进行，过程简便；
（3）能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的 问题；
（4）由于构成反胶团的表面活性剂常具有细胞破壁功能，因 此可直接从完整的细胞中提取具有活性的蛋白质和酶； （5）反胶团萃取的成本低，溶剂可反复使用。