实验一、免疫细胞的形态观察一、实验目的1、掌握微量采血及血涂片的制作方法。

2、在光学显微镜下观察免疫细胞。

二、实验原理血涂片是临床化验中最常规的技术，也是血液学研究中的最基本技术。

将血液样品制成单层细胞的涂片标本，经瑞氏（Wright）染液染色后，不同免疫细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。

根据细胞中颗粒的颜色大小及多少，再结合细胞的大小及细胞核的形态，就可以将免疫细胞进行分类计数。

三、实验器材1、器材：医用一次性采血针、酒精棉球、经脱脂洗净的载玻片。

2、试剂：瑞氏（Wright）染液，瑞特氏染料0.1克溶于60mL甲醇中，过滤。

贮藏褐色瓶中备用。

（配制时，要先将瑞特氏染料置研钵内边研磨边滴加甲醇，使染料溶解的更好。

）四、实验步骤1、采血采血前用75%酒精棉球消毒人的指腹或耳垂，干后用采血针刺破指腹或耳垂的皮肤；动物采血时先将耳部剪毛，酒精消毒后刺破动物耳部皮肤，挤去第一滴血不要（因含单核细胞较多）。

2、涂片挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光滑的载玻片，斜置于血涂片的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以30~40度为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（如图），推进时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀。

3、染色待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴瑞氏染液盖满血膜为止，染色1~3min。

然后滴加等量的缓冲液（pH6.4）或蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。

4、封片经染色的涂片完全干燥后，用中性树胶保存。

5、观察分别用低倍、高倍和油镜观察血涂片，分辨不同的血细胞类型。

五、实验结果拍摄血细胞照片，标出并分析比较各种免疫细胞类型和形态特征。

实验二、中性粒细胞吞噬功能试验（小吞噬试验）一、实验目的1、熟悉中性粒细胞的吞噬作用的原理和方法。

2、通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。

二、实验原理血液中的中性粒细胞即小吞噬细胞，通过趋化、调理、吞入和杀菌等几个步骤，能吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物，是机体非特异性免疫的重要组成部分。

在体外将中性粒细胞与细菌或异物颗粒在一定条件下共同孵育后，显微镜观察可见中性粒细胞内有细菌或异物颗粒。

计数吞噬有细菌或异物颗粒的中性粒细胞占中性粒细胞总数的百分率和每个中性粒细胞平均吞噬的细菌或异物颗粒，可反映中性粒细胞的吞噬功能。

有助于对疑有吞噬细胞功能障碍的疾病作出诊断。

该试验常用白色葡萄球菌作为中性粒细胞的吞噬物。

三、实验材料1、待测样本：新鲜抗凝静脉血。

（肝素溶液浓度为25U/ml，以生理下水配制）2、被吞噬物：白色葡萄球菌。

3、试剂：肉汤培养基，琼脂，无菌生理盐水，甲醇，瑞氏－吉姆萨染液。

瑞氏－姬姆萨染色液配制：原料：A：瑞氏染粉0.8--1克；吉姆萨染粉0.5克；B：甘油33ml；C：甲醇500ml。

配法：将A放入研钵中，加入少量B研磨，再加入少量B磨，再加入少量B磨……倒出，将未溶部分，继续加入B磨……>全溶，加入C，或中间加入C亦可。

4、器材：血红蛋白吸管，采血针，试管，EP管，平皿，75%酒精棉球、载玻片，微量移液器、恒温箱，显微镜（香柏油，二甲苯）等。

四、实验方法1、白色葡萄球菌液的制备用无菌生理盐水洗下白色葡萄球菌接种于普通斜面18～24h 培养物，置100℃水浴15min杀死细菌，经菌液计算后用生理盐水调整至6×108/ml，置4℃备用。

2、待测样本制备于洁净的0.5mlEP管内加20μl肝素溶液，用75%酒精棉球对受试者耳垂或指腹消毒，干燥后用采血针针刺，轻轻揉挤出血，用血红蛋白吸管吸取40μl，与EP管内的肝素溶液轻轻吹吸混匀。

3、孵育待测样本中加入白色葡萄球菌液20μl轻轻吹吸混匀，放入恒温箱37℃孵育30min，期间每隔10min摇匀一次。

4、制片取一小滴孵育后的待测样本于洁净载玻片上，用另一载玻片推成薄血膜，晾干后甲醇固定4～5min。

5、瑞氏－吉姆萨染色：滴加瑞氏－吉姆萨染液染色1～2min，水洗，晾干。

6、镜检置油镜下观察计数，计算吞噬率和吞噬指数。

五、实验结果计数200个中性粒细胞，分别记录吞噬细菌的细胞数和每个中性粒细胞吞入的细胞数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。

吞噬率＝(200个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数/200)×100%吞噬指数＝(200个中性粒细胞中吞噬细菌的总数/200)×100%【注意事项】1、所用器材要清洁。

2、如细菌数太多可增加稀释倍数作平皿培养后计数。

3、血膜必须充分干燥，否则在染色过程中易脱落。

4、染液不可过少，以防止蒸发干燥，沉着于血片上不易冲掉。

5、冲洗时应以流水将染液冲去，不可先倒掉染液，以免染料沉着于血膜上。

6、越接近推片末梢，细胞数越多。

计数时应取玻片前、中、后三段计数，以提高准确率。

【思考题】1、简述中性粒细胞吞噬功能测定的原理。

2、该实验过程中应注意哪些事项？附：小鼠中性粒细胞吞噬功能试验一、实验目的：同前。

二、实验原理：同前。

三、实验材料1、金黄色葡萄球菌悬液。

2、瑞氏染液、双蒸水。

3、试管、玻片、采血针、酒精棉球、吸管、滴管、显微镜、香柏油。

四、实验方法1、取小鼠一只，给腹腔注射金黄色葡萄球菌悬液0.6ml，10～15min。

2、取小鼠腹腔液。

3、置37℃水浴箱水浴15分钟，中途混匀一次。

4、取出小试管，用吸管将试管中血液打匀后取血半滴于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片。

5、待血片自干后，用瑞氏染液染色。

瑞氏染色法：取瑞氏染液数滴滴于上述血片上先染1分钟。

然后加等量蒸馏水，轻轻晃动混匀，继续染5分钟，水洗，用吸水纸吸干后镜检。

五、结果观察油镜检查：寻找中性粒细胞，如果染色结果正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而粒细胞的细胞浆则为淡红色。

中性粒细胞吞噬试验计数：1、吞噬百分率：观察100个中性粒细胞，计算其中吞噬有细菌的中性粒细胞数，计算出吞噬细胞百分率。

2、吞噬指数：观察100个中性粒细胞，计算其中被吞噬的细菌总数，平均每个中性粒细胞吞噬的细菌数即为吞噬指数。

实验五、双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验常用于定性检测，也可用于半定量检测。

将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶板上相邻近的小孔内，让它们相互向对方扩散。

当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。

根据有否出现沉淀线，可用已知的抗体鉴定未知的抗原，或用已知的抗原鉴定未知的抗体。

临床常用本方法检查原发性肝癌患者血清中的甲胎蛋白，作为原发性肝癌的早期辅助诊断。

甲种胎儿蛋白（α-Fetal protein, AFP），是胎儿组织及体液中的正常组织成份。

胎儿在第9周才出现此种蛋白，13～19周达高峰，到21周后逐渐下降，胎儿出生后该蛋白即行消失或含量甚微，普通试验方法检查不出，而肝癌病人及个别卵巢癌或睾丸癌病人的血清检出有此种蛋白。

一、实验目的1、熟悉双向琼脂扩散试验的原理。

2、掌握双向琼脂扩散试验的操作方法。

二、实验原理可溶性抗原（如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。

抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。

每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。

且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。

所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。

三、实验材料羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器（直径3mm）、湿盒、吸管等。

四、实验方法1、用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取4ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。

2、待琼脂凝固后，用打孔器打3个距离相近的孔，并用针头挑去孔中琼脂（孔距为5mm）。

3、在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。

4、将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

五、实验结果观察孔间沉淀线的数目与特征，一般可注意到以下几种现象：1、抗原与抗体孔间形成一条沉淀线，说明只有一种抗原与相对应的抗体特异性结合，如出现数条沉淀线，说明有几组不同的抗原和相对应抗体相结合2、根据抗原的成份可有以下三种现象：（1）若二孔中的抗原相同，与相应抗体形成的沉淀线融合成弧形；（2）若二孔中抗原不同，当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时，则形成的沉淀线相交叉；（3）若两孔中抗原部分相同，抗血清中有各相应的抗体，形成的沉淀线相切。

3、相应抗原抗体所形成的沉淀线，如二者浓度相当，沉淀线在孔中央，二者浓度不当时，则沉淀线偏向浓度低的一侧。