一种内生真菌Aspergillus flavus次生代谢产物研究岳婧怡;汤强;程旺开;徐迪【摘要】为了研究内生真菌Aspergillus flavus的次生代谢产物,利用硅胶、SephadexLH-20、反相、中压、高效液相制备等多种色谱方法从内生真菌Aspergillus flavus发酵液的乙酸乙酯萃取部位中分离得到7个化合物,并通过1 H NMR、13 C NMR、ESI-MS等波谱技术鉴定其结构,依次为:对羟基苯乙酸(1),对羟基苯乙醇(2),环(D)-脯氨酸-(L)-苯丙氨酸(3),Nb-乙酰基色胺(4),(E)-4-(4-hydroxyphenyl)but-3-en-2-one(5),N-isobutylacetamide(6),琥珀酸乙酯(7).所有化合物均为首次从该菌中分离得到.【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2019(047)007【总页数】4页(P84-87)【关键词】Aspergillusflavus;内生真菌;次生代谢产物【作者】岳婧怡;汤强;程旺开;徐迪【作者单位】芜湖职业技术学院, 安徽芜湖 241003;芜湖职业技术学院, 安徽芜湖241003;芜湖职业技术学院, 安徽芜湖 241003;芜湖职业技术学院, 安徽芜湖241003【正文语种】中文【中图分类】R91内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内真生菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境，而内生真菌以宿主植物的组织和细胞及其代谢产物为外环境，两者之间互相进行物质、能量及基因交流，在长期进化过程中与寄主协同进化，在演化过程中两者形成了互惠共生关系。
这种关系决定了内生真菌对宿主植物具有促生抗逆(抗干旱、抗病虫害等)以及有效成分合成积累的独特生物学特性。
此外，药用植物内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性成分，特别是还发现许多新的活性成分，这些活性成分被证明具有明显的抗癌、抗菌、抗氧化等活性[1-4]，这对今后从自然界中寻找更加丰富多样的生物活性母体先导化合物开辟新的途径。
本实验选取内生真菌 Aspergillus flavus，旨在探索发现结构新颖，生物活性较好的先导母体化合物，进一步从内生真菌中寻找新颖生物活性高的先导母体化合物，扩大天然产物探索途径奠定基础。
本研究采用经典次生代谢产物分离法，从菌株发酵物的乙酸乙酯萃取物中分离得到12个化合物，分别为对羟基苯乙酸(1)，对羟基苯乙醇(2)，环(d)-脯氨酸-(l)-苯丙氨酸(3)，Nb-乙酰基色胺(4)，(E)-4-(4-hydroxyphenyl)but-3-en-2-one(5)，N-isobutylacetamide(6)，琥珀酸乙酯(7)，所有化合物均首次从改内生真菌中分离得到。
1 仪器和材料质谱由VG AutoSpec-3000质谱仪测定；核磁共振由Bruker AM-400、DRX 500测定和AVANCE Ⅲ-600、AVANCE800核磁仪测定；分析型HPLC为Agilent 1100；制备型HPLC为Agilent 1260；MPLC为BÜCHI中压制备；柱层析和薄层层析硅胶均由青岛海洋化工厂生产；Sephadex LH-20为GE生产；所用试剂均为分析纯。
2 提取分离将Aspergillus flavus菌乙酸乙酯萃取部位粗提浸膏3.7 g，经中压色谱以甲醇-水(20:80～90:10，V/V)梯度洗脱得到5个组分(A-E)。
组分B经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮1:1洗脱，再经Sephadex LH-20柱甲醇洗脱纯化，最后通过高效液相色谱法(CH3CN/H2O, 10:90 → 25:75，25 min)制备得化合物1(4.7 mg)和化合物2(15.5 mg)。
组分C经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮2:1洗脱，再经Sephadex LH-20柱甲醇洗脱纯化，再利用高效液相色谱(CH3CN/H2O, 15:85→35:65，25 min)制备得化合物3(1.9 mg)、化合物4(1.4 mg)、化合物5(3.6 mg)、化合物6(7.6 mg)和化合物7(7.7 mg)。
3 结构鉴定图1 化合物结构式1～7Fig.1 Structure of compounds 1～7化合物1：白色针状结晶，分子式C8H8O3，易溶甲醇。
ESI-MS：m/z 151[M-H]-; 1H-NMR (CD3OD, 600 MHz) δ: 7.10 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2, H-6), 6.71 (2H, d, J=8.4 Hz, H-3, H-5), 3.40 (2H, s, H-7); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ: 128.0 (C-1), 131.2 (C-2, C-6), 116.0 (C-3, C-5), 157.1 (C-4), 42.7 (C-7), 176.0 (C-8)。
以上数据与文献[5]报道一致，故确定其为对羟基苯乙酸。
化合物2：白色粉末，分子式C8H10O2，易溶甲醇。
EI-MS：m/z 138[M]+ (45), 108 (20), 107 (100), 77 (22); 1H-NMR(CD3OD, 400 MHz) δ: 7.03 (2H, d,J=8.4 Hz, H-2, H-6), 6.70 (2H, d, J=8.4 Hz, H-3, H-5), 3.68 (2H, t, J=7.2 Hz,H-8), 2.71 (2H, t, J=7.2 Hz, H-7)。
文献[6]报道一致，故确定其为对羟基苯乙醇。
化合物3：白色粉末，分子式C14H16N2O2，易溶于甲醇。
ESI-MS：m/z 267 [M+Na]+; 1H-NMR (CD3OD, 600 MHz) δ: 7.21～7.37 (5H, m, H-2′, 3′, 4′, 5′, 6′), 4.36 (1H, brs, H-8), 4.28 (1H, ddd, J=1.0, 4.8, 5.0 Hz, H-9), 4.05 (1H, ddd, J=1.7, 6.3, 10.8 Hz, H-6), 3.48～3.57 (1H, m, H-3a), 3.33～3.39 (1H, m, H-3b),3.18 (1H, dd, J=4.8, 15 Hz H-10b), 3.14 (1H, dd, J=5.0, 14.4 Hz, H-10a),2.01～2.13 (1H, m, H-5b), 1.76～1.86 (2H, m, H-4), 1.20～1.24 (1H, m, H-5a)。
文献[7-8]报道一致，故确定其为环(d)-脯氨酸-(l)-苯丙氨酸。
化合物4：淡黄色油状物，分子式C12H14N2O，易溶于甲醇、丙酮，香草醛显紫红色。
ESI-MS: m/z 225[M+Na]+; 1H-NMR [(CD3)2CO, 400 MHz] δ: 7.57 (1H, d, J=7.8 Hz, H-4), 7.37 (1H, d, J=8.0 Hz, H-7), 7.15 (1H, s, H-2), 7.10 (1H, t, J=7.0 Hz, H-6), 7.02 (1H, t, J=7.1 Hz, H-5), 3.46 (2H, t, J=6.1 Hz, H-10),2.92 (1H, t, J=7.2 Hz, H-11), 1.84 (3H, s, CH3)。
文献[10]报道一致，故确定其为Nb-乙酰基色胺。
化合物5：黄色粉末，分子式C10H10O，易溶于甲醇，香草醛显绿色。
ESI-MS: m/z 163 [M+H]+; 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ: 7.50 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2’, 6’), 7.56 (1H, d, J=16.2 Hz, H-1), 6.78 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3’, 5’),6.62 (1H, d, J=16.2 Hz, H-2), 2.33 (3H, s, CH3)。
文献[11]报道一致，故确定其为(E)-4-(4-hydroxyphenyl)but-3-en-2-one。
化合物6：无色油状物，分子式C6H13NO，易溶于甲醇。
1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ: 2.98 (2H, d, J=6.8 Hz H-4), 1.93 (1H, s, H-1), 1.75 (1H, m, H-5), 0.91 (6H, d, J=6.8 Hz, H-6, H-7); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ: 22.4 (C-1), 172.4 (C-2), 48.0 (C-4), 29.5 (C-5), 20.4 (C-6, 6’)。
文献[12]报道一致，故确定其为N-Isobutylacetamide。
化合物7：分子式C8H14O4，白色粉末，易溶于甲醇。
1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ: 4.13 (4H, q, J=7.2 Hz, H-1′, 1″), 2.56 (4H, s, H-2, 3), 1.24 (6H, t,J=7.2 Hz, H-2′, 2″); 13C-NMR (CD3OD 125 MHz) δ:174.4 (C-1, 4), 30.2 (C-2, 3), 60.6 (C-1′, 1″), 14.4 (C-2′, 2″)。
文献[13]报道一致，故确定其为琥珀酸乙酯。
图2 化合物1的1H-NMRFig.2 1H-NMR of compound 1图3 化合物1的13C-NMRFig.3 13C-NMR of compound 1图4 化合物1的质谱Fig.4 ESI-MS of compound 1图5 化合物2的1H-NMRFig.5 1H-NMR of compound 2图6 化合物2的质谱Fig.6 EI-MS of compound 2图7 化合物3的1H-NMRFig.7 1H-NMR of compound 3图8 化合物3的13C-NMRFig.8 13C-NMR of compound 3图9 化合物4的1H-NMRFig.9 1H-NMR of compound 4图10 化合物4的质谱Fig.10 ESI-MS of compound 4图11 化合物5的1H-NMRFig.11 1H-NMR of compound 5图12 化合物5的质谱Fig.12 ESI-MS of compound 5图13 化合物6和7的1H-NMRFig.13 1H-NMR of compound 6 and 7图14 化合物6和7的13C-NMRFig.14 13C-NMR of compound 6 and 74 结论开展内生真菌的次生代谢产物研究是近些年来国内外寻找新颖活性成分的热点途径。