沉降菌测试方法1、把ф90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿包在报纸里，放入恒温烤箱中加热至180℃后，干烤2小时。

2、取X克培养基放入X克蒸馏水，放入高压消毒锅中加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。

3、待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于33℃恒温培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可采样用。

制备好培养皿宜在2—8℃环境中保存。

4、采样时，一般在100级层流罩中放置3个培养皿，在100000级，10000级按面积大小一般放2个培养皿。

打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上后倒置于恒温培养箱33℃培养，时间不小于48小时，采样点位置离地0.8m—1.5m左右。

5、将培养皿举起用肉眼直接计数，用记号笔点记然后用5—10倍放大镜检查是否遗漏，若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，分辨时仍以2个或2个以上菌落计数，不要漏计培养皿边缘生长菌落，并注意细菌菌落与培养基沉淀物区别。

6、沉降菌测试前，被测洁净室已消毒。

被测洁净室温湿度须达到规定要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值，测试状态有静态和动态两种，测试状态选择须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。

7、测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服，静态测试时，室测试人员不得多于2人。

测试时间对单向流100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始，对非单向流，100000级以上净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min 后开始。

8、平均菌落数计算：M 1+M 2+M 3 平均菌落数=.........21nMnM M ++ n —培养皿总数 M 1—1号培养皿菌落数 M 2—2号培养皿菌落数 M n —n 号培养皿菌落数用平均菌落数判断洁净空气中微生物。

洁净室平均菌落数必须低于所选定的评定标准，（100级≤1个；10000级≤3个；100000级≤10个）。

若某洁净室平均菌落数超过标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。

人员进出洁净生产区的一般程序：人员进出无菌操作洁净生产区程序：无菌医疗器具洁净室环境要求及监测：监测项目技术指标监测方法监测频次100级10000级100000级300000级温度（℃）18℃—28℃1次/班相对湿度% 45~65 1次/班水平层流风速m/s ≥0.4 ——————JC垂直层流1次/月≥0.3换气次数——≥20 ≥15 ≥12 1次/月静压差Pa 不同级别洁净室及洁净室与非洁净室之间≥5洁净室与室外大气≥10 1次/月沉降菌数≤1 ≤3 ≤10 ≤15 GB/T16294-1996 1次/周附录C（资料性附录）洁净室（区）沉降菌技术要求洁净室（区）沉降菌技术要求无菌检查法试验步骤无菌检查在洁净度100级单向流空气区域进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

1、器具灭菌：培养皿若干个（报纸所好）、试管、剪刀、镊子等装入盒中置电热干燥箱180℃，2小时。

2、硫乙醇酸盐流体培养基（细菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装至适宜的容器中，瓶塞封口，灭菌。

硫乙醇酸盐流体培养基置33℃培养48小时，应无菌生长。

改良马丁培养基（真菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装，灭菌。

改良马丁培养基置24℃培养72小时，应无菌生长。

营养琼脂根据实际用量按一皿装15ml，分装几个皿来计算，灭菌。

0.9%氯化钠分装至7支试管，封口，灭菌。

3、把金黄色葡萄球菌用接种环刮一下，放入0.9%氯化钠试管中摇匀，作10倍系列稀释至10-7，然后从10-5、10-6、10-7试管各抽取1ml，分别放入标号5#、6#、7#培养皿里，倒入营养琼脂摇匀，（营养琼脂不能太烫，以不烫手为准）待营养琼脂冷却后倒置放入33℃培养箱中培养48小时，48小时中取出观察计数，根据菌落数小于100cfu来决定用几号。

4、操作时，应用适当的消毒液对供试品表面或外包装擦拭消毒后，以无菌方法取容物。

取供试品3只接种于足以浸没供试品的适量培养基中。

一只瓣膜接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，轻轻摇动，使瓣膜与培养基混合，1支试管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml,作阳性对照，1支作空白对照。

另取2只瓣膜接种于改良马丁培养基中，2支试管作空白对照。

硫乙醇酸盐流体培养基置33℃培养，改良马丁置24℃培养阳性对照管培养48小时后应有菌生长。

5、结果判断：在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。

培养14天后，若供试品管匀澄清，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并有菌生长，判供试品不符合规定。

细菌毒素试验步骤：1、准备工作：移液管：0.1ml1支，1ml10支试管：10ml ×4支，试管架2个（大小） 烧杯40ml2个，锥形瓶2个试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性毒素，玻璃器皿置电热干燥箱180℃干烤至少2小时。

细菌毒素检查水10ml ×4支细菌毒素工作标准品1支，每安瓿含毒素10EU 鲎试剂 0.1ml ×8支 同一批号3支瓣膜 浸提介质：细菌毒素检查水浸提介质体积计算公式：V=L =8.6（ml ）8.6×3=25.8（ml）把细菌毒素检查水4支外表擦净打开，倒入烧杯中，用移液管取25.8ml倒入装3只瓣膜烧杯中，用锡纸封口，放进提前打开升温至37℃恒温培养箱中，培养1.5小时。

供试液贮存应不超过2小时。

注：V-浸提介质体积，单位为毫升（ml）L-产品细菌毒素限值，单位为细菌毒素单位每毫升（EV/ml）λ-所用鲎试剂灵敏度标示值，单位为细菌毒素单位每毫升（EV/ml）2、细菌毒素工作标准品用细菌毒素检查水1ml溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟。

①用移液管取0.1ml工作标准品和0.9ml检查水在旋涡混匀器上混匀30秒钟。

②用移液管从第1管中取0.5ml混合液和0.5ml检查水在旋涡混匀器上混匀30秒钟。

（阳性对照溶液）③用移液管取0.1ml工作标准品和0.9ml供试液在旋涡混匀器上混匀30秒钟。

④用移液管从第3管中取0.5ml混合液和0.5ml供试液在旋涡混匀器上混匀30秒钟。

（供试品阳性对照溶液）3、把8支鲎试剂外表擦净全部打开放进试管架中，每支各加入0.1ml细菌毒素检查水，在旋涡器上混匀，其中2支作供试品管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。

每支供试品管加入0.1ml供试液；阴性对照管加入0.1ml检查用水；阴性对照管加入0.1ml阳性对照溶液；供试品阳性对照管加入0.1ml供试品阳性对照溶液。

封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±1℃恒温器中孵育60±2分钟，然后取出观察结果，试管在孵育期间应避免任何振动。

4、结果判断：将试管从水浴箱中轻轻取出，缓缓倒转180若管形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性（＋），未形成凝胶或形成凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性（－）。

阴性对照管均为阴性，阳性对照管，供试品阳性对照管均为阳性，试验有效，否则无效。

若阴性对照管为阳性，表明鲎试剂或检查水或实验器具受污染；若阳性对照管为阴性，表明鲎试剂或标准毒素已失效，或鲎试剂灵敏度及标准毒素效价标示不准确或标准毒素稀释有误。

供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系有抑制反应干扰因素存在。

一、氯化物1、配制标准溶液：0.1mol/L硝酸银溶液。

称取1.6987g分析纯硝酸银，定溶至100ml容量瓶中，转入棕色试剂瓶中，避光保存，贴标签。

2、取样，量取50ml样品水平行样（2份）倒入试管中，加5滴硝酸，再加入1ml硝酸银。

均不得发生浑浊。

二、硫酸盐1、配制标准溶液：称取5±0.5g氯化钡（分析纯），定溶至100ml容量瓶，倒入试剂瓶，贴标签。

（如果浑浊，把蒸馏水烧开，放凉再用）2、分析：取样50ml平行样（2份）倒入试管中，加2ml氯化钡溶液，不得发生浑浊。

三、钙盐1、配制标准溶液：称取分析纯草酸铵3.5g，定溶至100ml容量瓶，贴标签。

2、分析：取样50ml平等样2份，倒入试管中，加2ml草酸铵溶液，均不得发生浑浊。

四、二氧化碳1、配制标准溶液：称取分析纯氢氧化钙0.3g，定溶至100ml容量瓶，用橡皮塞塞紧，用力振摇，放置1小时，用时取清液。

2、分析：取样25ml平等样（2份）倒入带盖的试管中，加25ml氢氧化钙溶液，放置1小时，振摇，1小时不得发生浑浊。

五、易氧化物1、配制标准溶液：①高锰酸钾溶液：取3.3克高锰酸钾，加水1050ml，煮沸15分钟，加水到1000ml，密塞后静置2天以上，用微孔玻璃漏斗过滤，摇匀，标定其浓度。

②稀硫酸：取分析纯硫酸（98%）57ml，（注意烧杯里放蒸馏水，沿杯壁缓慢倒入硫酸57ml，定溶至1000ml，放凉再用）2、标定：取在105℃干燥至恒重的基准草酸钠约0.2克，精密称定，加新沸过冷水250ml与硫酸10ml搅拌使溶解，自滴定管中迅速加入本液约25ml，待褪色后，加热到65℃，继续滴定至溶液显微红色并保持30秒钟不褪；当滴定终了时，溶液温度应不低于55℃，每1ml高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）相当于6.70mg草酸钠，根据本液消耗量与草酸钠取用量，算出本液浓度，即得。

贮藏：置玻璃塞棕色玻璃瓶中，密闭保存。

3、分析：取样100ml平行样（2份）加稀硫酸10ml，煮沸后，加高锰酸钾滴定液（0.02M）0.10ml，再煮沸10分钟，粉红色不得完全消失。

六、氨1、配制标准溶液①纳氏试剂：称取60g氢氧化钾，溶于约250ml无氨水，冷却至室温。

另外称取20g碘化钾溶于100ml无氨水，边搅拌边逐步加入二氯化汞结晶粉末（约10克），至出现朱红色沉淀不易溶解时，改为滴加饱和二氯化汞溶液，保持搅拌，到出现少量朱红色沉淀不易溶解时，停止滴加饱和二氯化汞溶液，然后把该溶液缓慢注入上述已冷却的氢氧化钾溶液中，边注入边搅拌，并用无氨水稀释至400ml，然后静置过夜。

最后将该溶液上清液至聚乙烯塑料瓶中，常温避光保存。

②氯化铵溶液：称取分析纯氯化铵0.0315g，定溶至1000ml（0.0032g 100ml）容量瓶中，转入试剂瓶中保存，贴标签。

2、分析：取样50ml，加纳氏试剂2ml，放置15分钟。

如果显色，加氯化铵溶液1.5ml，加无氨水48ml，加纳氏试剂2ml，对照颜色不得更深。

（氨含量0.00003%）七、重金属1、配制标准溶液①醋酸盐缓冲溶液：（PH=3.5）称取分析纯醋酸铵25g，加蒸馏水25ml溶解后，加盐酸液[7mol/L(称取0.0255g至100ml定溶至100ml)]38ml，再用盐酸液[2mol/L(称取0.0073g至100ml定溶)]准确调节PN值3.5（电位计指示）用水稀释至100ml，倒入试剂瓶待用。