2008年8月第16卷　第4期中国实验动物学报ACT A LABORAT ORIUM ANI M A LIS SCIE NTIA SINICA August ,2008V ol.16　N o.4研究报告Dicer 1转基因小鼠模型的建立郑志红1,高峰2,杨葳1,汪瑛1,于洋1,周生来1,李兆阳1,吕相川1,张梅英1,王禄增1(1.中国医科大学实验动物部,沈阳　110001;2.中国医科大学附属第一医院,沈阳　110001) 【摘要】　目的　建立Dicer 1转基因小鼠模型。

方法　构建pcDNA3112Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR 受体母鼠输卵管内。

出生后仔鼠用PCR 和S outhern 方法检测鼠尾DNA 鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer 1基因表达。

结果　显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR 检测获得6只阳性鼠,S outhern 检测6只均为阳性。

对S outhern 检测阳性转基因小鼠子代进行RT 2PCR 检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。

对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。

结论　成功建立Dicer 1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER 1基因功能及miRNA 的表达及功能等奠定基础。

【关键词】　Dicer 1;显微注射法;转基因小鼠【中图分类号】R -33 【文献标识码】A 【文章编号】100524847(2008)0420258203Establishment of a Dicer 1Transgenic Mouse ModelZHE NG Zhi 2hong 1,G AO Feng 2,Y ANG Wei 1,W ANG Y ing 1,Y U Y ang 1,ZH OU Sheng 2lai 1,LI Zhao 2yang 1,LU X iang 2chuan 1,ZH ANG Mei 2ying 1,W ANGLu 2zeng 1(boratory Animal Center ,China Medical University ,Shenyang 110001,China ;21The First A ffiliated H ospital of China Medical University ,Shenyang 110001,China )【Abstract 】　Objective T o establish a Dicer 1transgenic m ouse m odel.Methods pcDNA3112Dicer1construct was constructed ,linearized ,purified and then injected into superovulated pronuclear zyg otes to produce transgenic mice.The injected zyg otes were transplanted into the oviduct of pseudopregnant mice.The genotype of transgenic founders were identified by PCR and S outhern blot.The expressions of human Dicer 1protein in the tissues of the transgenic mice were detected by immunohistochemistry.R esults 172zyg otes were injected and 119zyg ote cells were transplanted into oviducts of 3recipients.15viable offsprings were born from 2of the 3recipients.G enomic DNA from baby tails was extracted.PCR and S outhern blot were used to identify transgenic founders of Dicer 1,and showed 6of the 15offsprings were positive transgenic mice of Dicer 11Dicer 1was expressed in the liver ,kidney and lung.Conclusion Dicer 1transgenic mice have been established success fully.The m odels will contribute to the research of Dicer gene function and the expression of miRNA.【K ey w ords 】　Dicer1;M icroinjection ;T ransgenic mice[基金项目]国家自然科学基金:30571836;辽宁省重点实验室专项资金:辽科发[2005]36号。

[作者简介]郑志红(1969-),女,研究方向:实验动物转基因与基因敲除。

E -mail :zhihongzheng @1631com[通讯作者]王禄增。

E 2mail :wanglz @1631com DICER 1基因与表观遗传调控密切相关,是2000年被克隆的,定位于人染色体14q32113,编码蛋白属于RNA 酶Ⅲ家族[1],在许多组织中广泛表达。

其功能是将具有颈环结构的RNA 或双链RNA剪切成长约21个碱基的成熟miRNA (或siRNA )[1]。

DICER 1蛋白是成熟miRNA 产生所必需的酶,DICER 1基因异常可导致不同组织、不同发育阶段miRNA 表达异常,DICER 1基因敲除的小鼠在胚胎发育过程中就发生死亡[2],无法通过敲除来详细研究该基因的功能。

由于DICER 1基因是发育过程中重要的调控基因,建立DICER 1转基因小鼠模型对研究该基因的功能具有重要的意义。

1　材料方法111　Dicer 1基因克隆及转基因构件制备按Dicer 1mRNA 序列设计正、反向引物,以MK N45(胃癌细胞系)细胞cDNA为模板,利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,PCR产物纯化后连接到pMD182T载体上,将连接产物转化感受态E.coli DH5α后进行质粒扩增并测序。

测序结果正确的pMD182T2Dicer用HindⅢ和K pnⅠ酶切回收目的片段并连接到pEG FP2C3载体的HindⅢ和K pnⅠ位点,转化、筛选并测序鉴定。

所得阳性克隆pEG FP2Dicer质粒用HindⅢ和ApaL Ⅰ酶切,回收目的片段与HindⅢ和ApaLⅠ酶切后的pcDNA311连接,经转化、筛选、测序鉴定阳性克隆。

所得到的阳性克隆,用PVUⅠ酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,用QI Aquick G el extraction K it试剂盒纯化回收约6100bp长的目的片段。

纯化后DNA溶于microinjection bu ffer(pH714)中,注射浓度为3ngΠμL。

112　供体小鼠的准备及显微注射11211　超排小鼠:选用SPF级BDF1小鼠,于第一天下午15:00腹腔注射PMSG5I UΠkg,46～48h后(第3天)下午14:00腹腔注射HCG5I UΠkg,当日与正常雄鼠1∶1同笼交配,第4天早晨检查阴道栓,见栓的母鼠做为供体鼠。

11212　采集受精卵:将阴道见栓的雌性BDF1小鼠采用颈椎脱位法处死,收集输卵管,在显微镜下将其用镊子撕开使卵团滑出,并加入适量的透明质酸酶消化受精卵周围的颗粒细胞,快速的用M2洗3～5次后在显微镜下记录受精卵数量,随即将其转入隔夜预孵育的M16培养液中,将受精卵置于C O2培养箱待注射。

11213　显微注射:按文献[3]介绍的方法进行显微注射,将注射后状态良好的胚胎在C O2培养箱内孵育30min后移植。

113　胚胎移植用1%戊巴比妥钠0145m LΠ100g腹腔注射将假孕ICR小鼠麻醉,酒精消毒后剪背肾部毛,切开皮肤、皮下组织,取出卵巢、输卵管、子宫,用脂肪镊固定卵巢脂肪垫。

靠近输卵管小弯处剪口,将移卵管从剪口处插入输卵管,将受精卵吹进壶腹部,略停片刻再拔出。

将卵巢、输卵管、子宫复位,缝合创口。

做好移植记录卡片。

114　转基因小鼠PCR检测剪取出生后15d的仔鼠鼠尾015～1cm,用酚、氯仿提取DNA方法提取鼠尾DNA。

引物序列为: F5′2GG C ATGGG AAG AAAT C AG CC23′,R5′2ATTG A TG TG T CC AATGG CCG23′,扩增片段长487bp,PCR 反应条件为:95℃5min;94℃50s→60℃50s→72℃50s,30循环;72℃延伸10min。

用1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

115　转基因小鼠Southern blot检测PCR检测阳性转基因小鼠及阴性对照鼠基因组DNA(约20μg)用HindⅢ过夜酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,经凝胶处理后采用毛吸印迹法使DNA转移到尼龙膜上,用紫外交联的方法使DNA固定于膜上。

用PCR扩增Dicer1基因片段作为探针,32P标记后,纯化探针,进行杂交,洗膜,放射自显影。

116　免疫组化法检测Dicer1基因的表达取转基因阳性1号鼠和C57BLΠ6小鼠心脏、肝、脾、肺、肾脏组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,制备石蜡切片。

使用免疫组化SP试剂盒(迈新公司),进行基因表达检测。

一抗anti2human Dicer (I MGE NEX公司)。

DAB试剂显色,苏木素复染,梯度脱水,中性树胶封片,显微镜下观察。

117　转基因小鼠传代转基因阳性原代鼠与C57BLΠ6小鼠交配繁殖,产生的子代通过PCR检测鉴定,建立转基因阳性小鼠系。

2　结果211　显微注射、移植、产仔情况共注射172枚卵,移植119枚卵,3只受体,其中2(2Π3,66167%)只怀孕,共产仔15只。

212　移植后出生小鼠PCR检测结果PCR检测阳性的子鼠共6只,出生阳性率4010%(6Π15),移植阳性率3102%(6Π119)。

部分结果见图1。

注:M:D L2000marker;+阳性对照(pcDNA3112Dicer1);-空白对照;N:正常BDF1小鼠;1、3、6:转基因阳性鼠;2、4、5、7、8:转基因阴性鼠 图1　部分鼠尾DNA PCR检测结果 N ote:M:D L2000marker;+positive control(pcDNA3112Dicer1plasm id);-control;N:negative control BDF1m ouse,1,3,6:transgenic m ice;2,4,5,7,8:non2transgenic m ice Fig.1　E lectrophoretic results of PCR products of thetransgenic mice213　Dicer1转基因小鼠Southern检测结果对6只PCR检测阳性的Dicer1转基因小鼠S outhern检测均有特异整合目的条带。