MALDI-TOF-MS
椭圆偏振光检测
表面等离子体共振（surface plasma resonance，SPR）
SPR原理
SPR检测
SPR检测
SPR检测
激光共聚焦
原位芯片光电检测器
AFM
5.2.6 高通量数据采集和处理
• 图像分析与处理
– 图像校正 – 平滑/滤波 – 去除污点 – 样斑识别 – 背景的确定 – 图像比较、扣除 – 绘图/显示界面
Incyte Pharmaceticals （美国） Incyte Pharmaceticals （美国） Molecular dynamics （美国） Nanogen （美国） Protogene Lab （美国）
压电打印PCR产物或芯片 上合成Oligos 压电打印PCR产物或芯片 上合成Oligos 500-5000nt的cDNA用笔打 印于10 cm2玻璃片 预组装的20mer的探针俘 获于电活化芯片位 点 通过打印于表面张力阵列 将40-50mer Oligo 合成于9 cm2玻璃 片 20-25mer探针合成后打印 成阵列 500-5000nt cDNA用滴头 打印于4 cm2的玻 璃片 约1000个PNA合成于 8×10 cm2的芯片
新基因鉴定 诊断及作图 新基因鉴定 表达谱检测 表达谱检测及诊断
荧光/质谱
目前国际上主要的芯片制造公司
蛋白质组研究技术路线
点阵芯片在蛋白质组学中的应用
点阵芯片用于蛋白质组学研究
生物芯片用于蛋白降解/MALDI-TOF-MS检测
基因诊断或蛋白定位
6、微流控芯片
• 20世纪90年代，Manz和Widmer提出了微全分析 系统（Miniaturized Total Analysis System, mTAS） • 微流控技术－在微米级结构中操纵纳升至皮升体 积流体的技术和科学。 • 微流控芯片以微通道网络及众多分析功能元件的 集成化为特征，微阵列芯片则以高密度的微探针 为特征。
表达检谱测多态性 分析诊断 表达检谱测多态性 分析诊断 新基因鉴定 表达谱检测 诊断及短的重复序 列鉴定 表达谱检测 多态性分析
荧光
荧光
Sequenom (德国，美国) Synteni （美国） 德国癌症研究所 （德国）
250点，激光解吸-质谱分析 10000个cDNA点与200标记 cDNA
质谱 荧光
6.2 微流控元件的加工
微流控元件包括：微阀、微泵、微混合器、微分离 器、微热交换器、微反应室等等。 6.2.1 微型阀：
– 有源阀：静电微阀、压电微阀、形状记忆合金（SMA） 微阀、电磁微阀、气动微阀、热气动微阀、无活动部 件的微阀 – 无源阀（被动阀）：常用作单向阀－往复式微泵
静电微阀
压电微阀
微泵中的双微阀
光刻图形转移过程
6.1.2.4 刻蚀
• 分为物理刻蚀和化学刻蚀（干法和湿法），主要 用于硅、石英（玻璃）等基质 • 湿法刻蚀中常见的刻蚀剂：
– 硅基质：HNA（HF+HNO3+HAc）、强碱（NaOH、 KOH等） – 玻璃基质：HF+NH4F
• 干法刻蚀：等离子体刻蚀和深度反应离子刻蚀 （利用射频激发）
• 数据分析与处理
– 数据保存 – 数据归一化及相关统计分析（聚类分析、主成 分分析、时间系列分析、曲线拟合、误差估计 – 数据校正 – 相应的计算 – 结果的显示（绘图） – 数据库及网络资源搜索 – 信息管理系统
5.2 微阵列芯片的应用
目前微阵列芯片的应用已经遍及生物、医学 的各个领域，如：
• 生物芯片具有高通量、微型化和自动化的特点， 生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、生化 反应到检测的整个分析过程集成化以获得所谓的 微型全分析系统或称缩微芯片实验室。 • 应用领域包括：生物科学（基因组学，DNA测序）， 医药（药理学，高通量药物筛选，毒理学，药物 基因组学，药物分析，疾病诊断，遗传病基因检 测），农业、食品和环保（环境检测和防治，农 作物优育和优选 ，食品卫生监督），国防、航天 航空领域等
6.1.3 聚合物芯片的加工：
聚合物芯片上的微结构是通过模具转移的，加工 方法有： – 注塑法 – 原位聚合法 – 热压法 – 激光刻蚀法
模具制备过程
6.1.4 芯片表面改性技术
• 玻璃/石英芯片表面的改性技术
– – – – – – – 动态涂层玻璃表面改性技术 纤维素衍生物动态涂层表面改性技术 金纳米颗粒动态涂层表面改性技术 集成反应室中的动态涂层表面改性技术 玻璃表面永久改性技术 聚丙烯酰胺涂层表面改性技术 聚乙烯醇（PVA）涂层表面改性技术
2、生物芯片的历史
• 1987，美国阿贡国家实验室的Drmanac提出了用杂交 法测定核酸序列 • 1988，英国牛津大学的Southern取得了在载体上固定 寡核苷酸及杂交法测序的国际专利 • 1994，美、俄共同出资1000万美元研制出一种检测 地中海贫血的基因芯片 • 商业化芯片公司包括： Affymetric、 Packard、 General Scanning Inc、Telechem、Amersham Pharmacia Biotech、Clontech、Hyseq、Protogene、 Synteni、Nanogen、Incyte Pharmaceuticals、 Genetic 、Sequenom等等
微流控芯片
微流控芯片
6.1 微加工技术及芯片制备 6.2 微流控元件的加工 6.3 微流体控制技术 6.4 微流控芯片检测系统 6.5 微流控芯片的应用
6.1 微加工技术及芯片制备
6.1.1 芯片材料：
–硅 – 石英，玻璃 – 硬质高分子聚合物（聚碳酸脂PC、聚甲基丙烯酸甲酯
PMMA、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET等）
生物芯片技术
1、生物芯片
• 生物芯片是指能对生物成分或生物分子进行快速/ 并行处理和分析的微型固体薄型器件。 • 生物芯片是缩小了的生物化学分析器，通过芯片 上的微加工技术获得的微米结构和生物化学处理 结合，将成千上万乃至几十万个与生命相关的信 息集成在一块很小尺寸的芯片上，以实现对细胞、 蛋白质、核酸以及其他生物分子的准确、快速、 高通量的信息采集、分析和处理。
• 分支探针：为了提高检测灵敏度，采用携带多个 信号单元的分支分子作为探针，信号单元可以是 同位素标记（如32P、33P、35S、3H），也可以是非同位 素标记（如荧光素、生物素、酶、化学发光配基等等）
分支探针
5.2.5 检测技术
• • • • • • • • • • • • • • • • 紫外 荧光 电化学 质谱（如MALDI-TOF、ESI、SEIDI） ELISA 同位素，多光子检测（MPD） 光散射 化学发光 表面等离子体共振（成像）检测（SPR） 光/电探测器原位检测 非接触AFM 免疫测定 二维波导 表面增强激光解析/离子化（SELDI） 椭圆偏振成像技术 （激光）拉曼光谱
检测 荧光
应用领域 表达谱检测多态性 分析诊断 诊断、表达谱检测 及新基因鉴 定 诊断、表达谱检测、 多态性分析、 新基因鉴定 及大规模测 序
质谱
Hyseq（美国）
500-2000ntDNA样品印刷 于0.6cm2/18cm2的 膜 预组装的5mer-Oligo打印 于1.15的玻璃片
同位素
通用1024个Oligo点探测 10kbcDNA样品，加 标记的5mer探针和连 接酶
公司 Affymetrix （美国） Brax（英国）
阵列方法 20-25mer探针光引导合成 在1.25/5.25cm2的硅 片 Oligo合成后结合于芯片上
杂交方式 10000-260000个 Oligo探针与 30-40个标记样品 cDNA/asRNA片断 通用芯片上100个探针与标 记核酸 64/55000个样品cDNA点与 8000/300个7mer探针
芯片基质
载体的活化
5.2.2 芯片的制作
样品点阵制作方法：
• 点接触法：接触加样 • 喷墨法：通过压电陶瓷或气压将样品喷射 到芯片表面 • 光刻法：通过光刻胶和掩膜在芯片表明键 合样品或刻蚀通道 • 丝网印刷：以丝网和感光胶制作丝网印版， 借助印刷技术将传感器、相关电路或辅助 基质加到芯片上
样品点阵的制作
5.2.3 样品的键合
样品的键合
5.2.4 生物探针分子的选择和设计
• 寡聚核苷酸探针：用于DNA、RNA杂交 • 生物标记：荧光素、荧光蛋白、稀土（络合物）、半导体纳米晶
体、分子信标、同位素、金（银）纳米粒子
• 核酸类似物：
– 肽核酸（PNA）探针：以（2-氨乙基）甘氨酸结构单元为骨架， 碱基通过亚甲基羰基连接于骨架上，可高亲合地结合DNA或RNA – 锁状核酸（LNA）探针（2'-O和4'-C通过亚甲基成环）
5.2.1 芯片载体的选择 5.2.2 芯片的制作（样品的键合或原位合成） 5.2.3 样品的键合 5.2.4 生物探针分子的选择和设计 5.2.5 检测技术 5.2.6 高通量数据采集和处理
5.2.1 芯片载体的选择
• 载体的要求：活性基团、稳定、生物相容 性） • 材料：无机、天然有机聚合物、合成高分 子、高聚物制作的膜，常见的有玻璃、金 属片、高分子片/膜 • 载体的活化（样品键合）
3、生物芯片的类型
• 按照芯片键合的配基分类： 基因（DNA）芯片、蛋白芯片、多肽芯片、细胞芯片（药物筛选细 胞芯片、细胞膜电位芯片、神经生物芯片）、组织芯片（石蜡切片芯片、肿瘤组
织芯片）等。
• 按照芯片结构分类： 微阵列（点阵）芯片（包括DNA芯片、蛋白芯片、SPR芯片、QCM芯片等）、 微流控芯片（包括过滤分离芯片、电促/电转移芯片、生化反应芯片、毛细管电泳 芯片、色谱芯片、PCR芯片、质谱芯片等）、芯片实验室（微全分析系统，
– 弹性聚合物（聚二甲基硅氧烷PDMS） – 光敏聚合物（SU-8） – 其它（聚酰亚胺、金属等）