革兰染色法是基于细菌细胞壁成分和结构的不同，可 将细菌分为革兰阳性菌 （G+）和革兰阴性菌 （G－）。
2
实验材料
菌种
表皮葡萄球菌 （Staphylococcus epidermidis） 大肠埃希菌 （Escherichia coli）
器材
载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、染色架
革兰染液
3
实验步骤
staining） 革兰氏染色法 （Gram staining）
细菌微小、半透明，在普通 光学显微镜下不易识别。 将细菌染色，增加反差，便 于观察。 革兰氏染色法是细菌学中广 泛使用的一种鉴别染色法。
Hans Christian Gram
革兰染色在临床上有助于细 菌致病性分析及抗菌药物选 择。
1
实验原理
染色标本制备
涂片 干燥 固定 染色 镜检
4
染色标本制备
1. 涂片 在载玻片上标记菌名（s.e和 e.c），然后用接种环各滴加1环生理 环 盐水，将接种环在火焰上烧红，待 冷却后挑取少量 少量菌种与玻片上的水 少量 滴混匀后，在载玻片上涂布成一均 均 薄层，菌膜直径在0.5~1cm。 匀的薄层 薄层 2. 干燥 涂好的菌膜在室温下自然干燥。 3. 固定 手持载玻片的一端，菌膜面向上， 在火焰最热部分迅速通过3次，待玻 次 冷却后方可染色。 片冷却 冷却
媒染
• 滴加95%酒精 酒精数滴，20~30s，见紫色脱下 酒精 立即水冲洗。 脱色 • 滴加石炭酸复红液，染1min，水冲洗， 石炭酸复红液， 石炭酸复红液 用滤纸印干水分。 复染
8
涂片
干燥
固定
染色
镜检
待染色片充分干燥 充分干燥后，用油镜观察。 充分干燥
9
制片的注意事项
1. 载玻片要洁净无油迹。 2. 滴生理盐水不要过多。 3. 挑菌量宜少。 4. 涂菌的动作要轻，防止菌液迸溅。 5. 涂片要均匀，菌膜宜薄。 6. 沾有细菌的接种环要及时火焰灭菌。
11
实验结果
菌名 表皮葡萄球菌 大肠埃希菌 菌体颜色 菌体形态 G+或G－
思考题
1. 哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？ 2. 你的结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
12
注意
实验完成后，将染色片放入盛有石炭酸消 毒液的玻璃缸内，切记乱放。
13
10
革兰染色的注意事项
1. 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的 一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。 2. 选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老， 由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 3. 酒精脱色 酒精脱色是革兰染色的关键，要掌握好脱色的时间。 脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌； 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
5
涂片
干燥
固定
染色
镜检
6
革兰染液
第一液（初染液）： 结晶紫染液 第二液（媒染液）： 卢戈碘液 第三液（脱色液）： 95%酒精 第四液（复紫 结晶紫覆盖菌膜，染1min，自来水 结晶紫 染 缓缓冲洗。 初染 • 滴加卢氏碘液 染1min，水洗。 卢氏碘液，染 卢氏碘液