微生物细胞计数及染色操作
河南师范大学 环境科学与工程实验教学中心
一、目的要求
• 学会血球计数板的使用方法
• 了解革兰氏染色的原理 • 学习并掌握革兰氏染色的方法
二 酵母细胞计数原理
微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和 间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计 数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者 是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时 太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数 前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运 算后，即可得出实际数值。
2．思考题 （1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？
其染色成败的关键一步是什么？
（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样能确证你的染色技术操作正确，结果 可靠？
• 9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。20. 6.2820.6.28Sunday, June 28, 2020
(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上 加盖专用的厚玻片。
(4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖 玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水
纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数 室内。
(5)计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要 按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格 （即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格 ×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需 再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。
• 麦芽汁培养基、酵母菌。 • 吸管、吸水纸等。
四、实验步骤
（一） 染色实验
1．涂片：将培养24小时的大肠杆菌和未 知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆球 菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于 浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰 1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫 手为宜。
．染色
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。
• 碱性染料初染液——结晶紫（crystal violet）
• 媒染剂——碘（iodine）
• 脱色剂——95％的酒精（ethanol）
• 复染液——番红
三、实验器材
• 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌；
• 草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95% 乙醇，载玻片，显微镜等。
• 显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球 计数 板、载玻片等。
细菌染色基本原理
• 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。 • 它是1884年由丹麦医师Gram创立的。 • 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌
的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色 反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示； 染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性 细菌，用G-表示。 • 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细 胞壁的成分和结构不同而造成的。
（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一 分钟，水洗。
（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以 白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚 不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即 用水冲净酒精。
（4）复染：用番红液染1～2分钟，水洗。
（5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革 兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准， 过于密集的细菌，常常呈假阳性。
计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格， 每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中 格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一 种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格 都是由16×25=25×16=400个小方格组成，见图。
2.血球计数板的使用 (1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。 (2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每 小方格内含有4-5个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即 可。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽 孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
• 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度， 如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱 色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌 龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或 已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
大肠杆菌革兰氏染色
细胞壁 强度 厚度
肽聚糖层数 肽聚糖含量
磷壁酸 外膜
脂蛋白 脂多糖
革兰阳性菌 较坚韧 20-80nm
可多达50层 占细胞壁干重50%-80%
+ — — —
革兰阴性菌 较疏松 10-15nm 1-2层
占细胞壁干重5%-20% — + + +
• 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料 （basic dye）初染液；媒染剂 （mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
肽聚糖(peptidoglycan)
革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥
N-乙酰葡糖胺 N-乙酰胞壁酸
溶菌酶作用点
青霉素作用点
肽聚糖(peptidoglycan)
革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链
革兰阳性菌细胞壁特殊组分
膜磷壁酸 壁磷壁酸
革兰阴性菌细胞壁特殊组分
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较
炭疽芽胞杆菌
(二)酵母细胞数的测定操作方法 1.血球计数板的构造
血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻
片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。 中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半， 每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个 大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供 微生物计数用。这一大方格的长和宽各为1m，深度 为，其体积为0.1mm3。
4.血球计数板的清洁 血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切
勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹 干，或用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮等有 机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格 内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净， 则必须重复清洗直到干净为止。
五、实验报告
1．结果
列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌 的染色反应，并判断它们分别是G-或G+.