A
B
C
A.用多功能试剂交联；B.共价或非共价连于载体上 C.包埋到载体的紧密孔中
二、非共价修饰
反相胶束 添加剂

蛋白质间非共价相连，形成的多聚体或者
聚合体的活力和稳定性常比单体高
反胶束是由两性化合物在占优势的有机相中形 成的。它不仅可以保护酶，还能提高酶活力， 改变酶的专一性。
反相胶束示意图
固定化可通过下列效应影响酶的稳定性：
空间障碍：由于空间障碍可以防止蛋白水解
酶的作用，阻挡酶与化学失活剂的接触，同时
阻碍氧向酶的扩散可以保护对氧不稳定的酶
扩散机制: 使酶发生交联或包埋在载体紧
密的孔中可以使酶的构象更加坚牢，从而阻止
酶构象从折叠态向伸展态过渡。
一 酶固定到载体上后可产生空间障碍，结果其他大
质信息进行基因和蛋白质序列的改造， 通过定
点突变使得所表达的蛋白质产生相应的特征改
变。
组合设计（combinational design）
和数据驱动设计（data-driven design）
是另外两种最新的可以提高蛋白质稳定
性的蛋白质工程技术。
组合设计:
是通过一种策略使得在基因水平上产生 差异化，同时，通常需要大量的高通量筛选 来鉴别设计是否获得成功。组合设计方法的 目标在于通过在蛋白质随机位点引入随机突
进化目的的一种技术。
随着突变方法、突变体高通量筛选技术、基因结
构与功能研究的突破，特别是PCR 技术的进一步
成熟，DNA 改组技术(DNA shuffling)更加成熟，
使得DNA 改组成为蛋白质体外分子进化的主流技
术。
DNA 改组技术具有许多重要优点， 例如不需要
事先了解结构信息，也不需要了解蛋白质的功能
分子难于与酶作用，因此，固定到载体上的酶往
往能抵抗蛋白水解酶的降解作用，这也是防止蛋
白水解酶自溶的原因
二 底物、配体和氢离子浓度在载体附近和整体溶液 之间的分布不均一，造成载体周围的局部浓度与 整体浓度不同，也就是酶的微环境发生了变化
三 当酶包埋在多孔颗粒内，底物必须先扩散到颗
粒表面（外部质量传递），然后进入颗粒内部
六、变性剂：
1.脲和盐酸胍:机制尚不明确,可能是消除了维持三级结构的 疏水作用力或直接与蛋白质分子作用.
2.高浓度盐：高浓度盐既有稳定作用也有变性作用，这要
看盐的性质和浓度。
3.螯合：常常不可逆地失活需要金属辅因子的酶，但可稳
定不需要金属辅因子的酶； 4.有机溶剂：改变溶液的介电常数;增加疏水核的溶解度,降 低带电表面的溶解度;夺去酶分子表面的必需水而使酶 失活.
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
第一节: 蛋白质的稳定性 一. 蛋白质稳定性的分子原因

蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种 因素的影响,保持其生物活力的能 力。
维持蛋白质结构稳定的主要因素:
1.金属离子、底物、辅因子和其他相对 低分子质量配体的结合作用
金属离子由于结合到多肽链的不稳定 部分（特别是弯曲处），因而可以显著增 加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子 和其他低相对分子质量配体相互作用时， 也会看到蛋白质稳定性的增加。
（内部质量传递），酶才能与其作用，这些扩散
限制可明显使固定化酶“稳定化” 外扩散：底物必须从流动的水溶液传递到固定化
酶颗粒外表面 内扩散:底物进一步传递到固定化酶颗粒内部
四 将酶多点共价连接到载体表面，或用双功能 试剂交联酶，或将酶包埋在载体紧密的孔中， 可以使酶构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折 叠态向伸展态过渡。
原因：
修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的




更稳定的构象； 修饰关键功能基团也会达到稳定化； 由化学修饰引入到蛋白质的新的功能基团 有可能形成附加氢键或盐键； 用非极性试剂修饰可加强蛋白质中疏水相 互作用； 蛋白质表面基团的亲水性； 交联酶晶体
酶的失活和再活化
对于可逆性酶，可以采取相应措施实现其 再活化 例如：用过量的碘离子使脲酶重新天然化， 该酶失活是由于重金属阳离子使巯基中毒 引起，再活化的机理是碘离子与结合的金 属离子形成碘结合物 对于不可逆变性酶，可用下述方法进行再活 化：用变性剂使固定化酶伸展成无规则盘 绕状态
pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个 过程原则上是可逆的,但这些变化常能导致 不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活.
四、氧化作用:
各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基 酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基，从 而使蛋白质变性。分子氧、H2O2和氧自由基 是常见的蛋白质氧化剂。
五、表面活性剂和去污剂
表面活性剂在很低浓度下能使蛋白质发 生强烈的相互作用,导致蛋白质不可逆变性. 其中阴离子去污剂的作用比阳离子和非离子 去污剂强烈.
七、重金属离子和巯基试剂:
与蛋白质的巯基、二硫键以及色氨酸、组 氨酸残基反应。
八、热:
热失活是工业上最经常遇到的酶失活的 原因.热失活分二步过程:伸展---不可逆失活.
九、机械力：
振动、剪切、超声波、压力都可能引起 蛋白质的变性。这种变性理论上是可逆的，但 也可能伴随着其他反应而不可逆地失活.
十、冷冻和脱水：
优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。
优点：提供了有目的改变酶性能的可能性，
不仅改变酶的结构，也可以改变其催化活力及专
一性和稳定性。
改变蛋白质稳定性的蛋白质工程方法
①DNA改组技术 ②定点突变技术
③组合设计
④理性设计
DNA改组技术的定义
DNA 改组( DNA shuffling ), 也称分子育种
关系，其缺点是需要配合快速、可靠的鉴别突变 体的方法。
定点突变技术(Site-directed mutagenesis)是在
已知蛋白质中取代、插入或删除特定的氨基酸
残基，从而改变蛋白质的结构和对应功能，又
被称为理性设计(rational design)。它可以作为
DNA 改组技术的有益补充， 是基于基因和蛋白
最新进展
可将变性的蛋白质分子孤立在反胶束
内，蛋白质在反相胶束内可重新折叠成天
然状态，而且没有与其他变性分子接触和
聚合，此胶束由表面活性剂稳定的水滴构
成，并悬浮于异丁烷中。
第四节 各种酶稳定化方法的比较
比较各种不同的酶稳定化方法是困难的，因 此制定的了一下一般的标准：
①稳定性至少要增加1~3个数量级 ②应对各种酶失活因素(物理，化学及生物学因素) ③稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一性 ④稳定化方法适合各类蛋白质 ⑤稳定化方法应在体内，体外都适用 ⑥从经济角度看，方法应具有方法的潜力
蛋白质的聚合作用和沉淀的区别：
1.蛋白质的聚合作用可能是可逆的,并不一 定是不可逆的. 2.沉淀作用意味着蛋白质并未发生显著的 构象变化即从溶液中析出。因此，沉淀很 容易再溶于水溶液中，并恢复其全部天然 特性。
三、极端pH:
极端pH下引起蛋白质变性的重要因素 是：一旦远离了蛋白质的等电点的，那么 蛋白质分子内相同电荷间的静电斥力会导 致蛋白质伸展。从而使埋藏在蛋白质内部 非电离残基发生电离，导致失活。
6.氨基酸残基的坚实装配
溶液中的蛋白质似乎装配紧密，其紧密程 度类似于低相对分子质量化合物的晶体状 态，尽管如此，蛋白质结构中仍有空隙。
空隙中充满水分子，会导致蛋白质不稳定， 因此除去孔隙中的水分子，蛋白质结构变 得更坚实，稳定性也增加。
7.疏水相互作用
疏水性大小与稳定性没有必然的联系 非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排 列是稳定性的原因之一 增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:
氢键：是通过氢原子参与成键的特殊形式 的化学键。 当一个电负性较强的原子与氢键合后， 继续与另一个电负性较强的原子键合： 氢键能维持二级结构(如α-螺旋，β-片 层，β-转角等）。但是氢键对蛋白质稳定 性的重要性不应估计过高。
4.二硫键
二硫键：即S－S 键， 是2 个巯基被氧化而形 成的-S-S-形式的硫原子间的共价键。 链内二硫键和链间二硫键：
2蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用
由于蛋白质分子表面上既有疏水簇，也 有极性和带电基团。从热力学上看，疏水 簇与水的接触对蛋白质稳定性是不利的。
所以当蛋白质形成复合物时，脂分子或 蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏 水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表面的 疏水区域。

3.盐桥和氢键
盐桥：当一个氨基酸的氨基和与它空间相 邻的另一个氨基酸的羧基互相靠近时，形 成盐桥。 -COO.......H3N蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白 质的稳定性作用很显著。
添加剂
专一性底物及配体; 非专一性中性盐和多羟基物质;
与失活剂竞争的物质或除掉破坏化学催化
剂的物质
添加剂不仅可以提高酶的热稳定性，还
可提高酶的抗蛋白水解，抗化学试剂，抗
PH变化，抗变性剂，抗稀释作用 例如：甘油，糖和聚乙二醇是多羟基化合 物，能形成很多氢键，并助于形成“溶剂 层”，增加表面张力和溶液黏度，这类添 加剂通过对蛋白质的有效脱水，降低蛋白 质水解作用而起稳定酶的作用
冷冻和脱水时，溶质被浓缩，引起酶微 环境中pH和离子强度的剧烈改变，减弱疏水 相互作用,并可能引起二硫交换和巯基的氧化。
十一、辐射作用:
辐射可产生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直
接或间接地作用于蛋白质分子.
第三节 蛋白质的稳定化
酶的稳定化方法
固定化 非共价修饰
化学修饰
④蛋白质工程
一 固定化
由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸 展蛋白质的熵急剧降低，从而增加蛋白质 的稳定性。
与此类似，用双功能试剂实现分子内交 联，也能使蛋白质构象稳定化。
日常生活中的烫发和发型保持， 主要原理是操 纵毛发角蛋白二硫键的还原和再氧化， 即二硫键的 断开和重新键合。