制剂中使用抗氧化剂常出现的问题
• 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 • 2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS ）， 磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧 化 • 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度 依赖性，多数发生在PH6-7 • 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸 氢盐加速胰岛素破坏
缓冲液
• 目的：用于防止溶液中小的PH值改变，这些改变 影响着蛋白质可溶性和稳定性。 • 注意的问题： • 1.放大及生产规模中找到满足要求的缓冲系统可 能困难，需要借助于酸碱调节。它们可能改变缓 冲系统的缓冲能力，离子强度。 • 2.为更好的控制PH，增强缓冲能力将显著提高离 子强度。 • 3.普通的酸和/或碱催化可能加速蛋白质的降解。 • 4.冷冻干燥过程中缓冲液的结晶化可能改变溶液 冷冻浓缩时的PH，影响药物稳定性。
2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法
• 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨 酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及 氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、 金属离子及各种自由基激活剂。 • 2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能 导致二硫键的形成和生物活性的丧失。 • 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且 可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作 用和与重金属发生配位作用。 • 4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。
其它蛋白质化学不稳定性及制剂方 法
• 1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下 显著加速； • 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和 赖氨酸 • 对策：降低PH • 2.二硫键断裂 • 原因：温度过高 • 对策：降低温度
• 3.巯基与二硫键 • 在蛋白质的三级结构中，二者起主导作用， 当二硫键交换并导致三维结构发生变化时， 生物活性可能丧失 • 原因：亲核、亲电试剂导致的可逆破坏； • 高温、极端的PH • 二硫键的交换
蛋白质制剂中的抗氧化剂和螯合剂
试剂 抗氧化剂（所以水溶液） 抗坏血酸（异抗坏血酸、抗坏血酸钠） 亚硫酸盐（亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、 亚硫酸钠） 硫甘油 巯基乙酸 半胱氨酸盐酸盐 螯合剂（所有水溶液） 乙二胺四乙酸（EDTA）（通常为钠盐） 0.05-0.1 柠檬酸/柠檬酸盐 0.02-1 0.1-1.0 0.1-0.5 0.1-0.5 0.05-0.2 0.1-0.5 制剂中的使用浓度/%
防止氧化降解的措施
• • • • • • 1.低温下制备与储藏 2.使用螯合剂消除金属催化反应 3.提高离子强度，减少二硫键的形成 4.消除过氧化物和金属污染物 5.避光 6.注意光反应和磷酸盐缓冲液条件下可能形成游离基的反 应 • 7.生产过程中用氮或氩代替氧 • 8.当需维持所需蛋白质的可溶性和抗水解稳定性时，尽可 能在低PH下进行，因为抗氧化稳定性与PH呈负相关。 • 9.为抑制游离基形成和微量金属离子所导致的蛋白氧化， 使用螯合剂
蛋白质的不稳定性
1、物理不稳定性 变性、聚集、吸附、大分子的可溶性 2、化学不稳定性 水解、氧化、消旋、质 大量潜在的反应位点 大量离子化位点 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 有二级、三级、四级高级结构 分散（胶体）水相 温度效应是间断的（变性） 易支持微生物生长 小分子 很少反应位点 很少离子化位点 缓冲作用通常是广泛的酸/碱催化 没有高级结构 溶液中为单一相和连续相 温度效应是连续的
1.PH、水解和缓冲液
• 稳定性、可溶性和PH遵循一个规律： • 高溶解度导致低化学稳定性；低溶解度导 致低物理稳定性。 • 例子：胰岛素溶解度与脱氨反应
• • • •
1.水解和脱氨反应 氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺 影响因素：极端PH、温度和离子强度 最明显的例子：中性和碱性条件下提高蛋 白质的脱氨速度（主要是Asn--Gly），脱氨 速率高于水解速率 • 改善方法：降低PH。酸性PH条件下脱氨速 率低于中性和碱性PH，但是PH的降低可能 导致Asp-X（小分子侧链，甘氨酸或丝氨酸） 残基处的裂解或环化。
外消旋作用
二硫键交换 冷冻干燥过程中的变性 凝集、沉淀 表面吸附
控制PH、缓冲液
硫醇的消除（如半胱氨酸） 防冻剂/防失水剂 控制PH、表面活性剂、减低机械压 力 表面活性剂、白蛋白、预饱和
化学稳定性
• 1.PH、水解和缓冲液 • 2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法 • 3.其它化学不稳定性及制剂方法
蛋白质药品中添加剂的作用
• • • • 1.抗微生物保藏剂 2.可溶性增强剂 3.冻干产品填充剂 4.等渗溶液添加剂
蛋白质中常见的稳定性与相容性问 题及解决方法
稳定性问题 水解、脱氨（如天冬酰胺） 氧化（如甲硫氨酸氧化） Β-消除反应 转肽作用 可能的解决方案 控制PH、缓冲液、低离子强度 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加 工与包装过程 低PH、螯合剂 控制PH、低浓度