免疫荧光技术(检测抗核抗体(ANA)得实验方案)荧光免疫技术就是以荧光物质标记得特异性抗体或抗原作为标准试剂,用于相应抗原或抗体得分析鉴定与定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术与荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术就是用荧光抗体对细胞、组织切片或其她标本中得抗原或抗体进行鉴定与定位检测,可在荧光显微镜下直接观察结果,称为荧光免疫显微技术,或就是应用流式细胞仪进行自动分析检测,称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定与荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(AＮＡ)为例进行实习、抗核抗体(aｎtinｕclear anｔibodｙ,ANA)又称抗核酸抗原抗体,就是一组将自身真核细胞得各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNＡ、可提取得核抗原(ＥNA)与ＲNＡ等作为靶抗原得自身抗体得总称,能与所有动物得细胞核发生反应,主要存在于血清中,也可存在于胸水、关节滑膜液与尿液中、抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Heｐ－2)作抗原片,将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA,就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记得抗人ＩgG抗体又可与ANA结合,在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
试剂与器材1.抗原片现多用商品试剂。
如需自行制备,方法如下:(１)肝印片制备:取4-8周龄小鼠,断颈杀死后,剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块,用生理盐水洗去血细胞,用滤纸吸干渗出得浆液。
将切面轻压于载玻片上,使其在载玻片上留下薄层肝细胞。
冷风吹干,乙醇固定,冰箱可保存1周。
(2)Hｅｐ—2细胞抗原片制备:Hｅp－２细胞就是建株得人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片,用洗涤洗去培养基。
干燥后,用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备:取小鼠肝组织作冰冻切片,厚４μl。
-3０℃保存备用。
2.异硫氰酸荧光素(ＦITC)标记得抗人IgＧ抗体(FITC—抗人IｇＧ抗体)有商品供应,临用时按效价稀释。
３、0、０1mｏl/Ｌ pＨ7。
2 ＰBS４。
缓冲甘油取甘油9份加PＢＳ 1份、5。
待测血清、阳性与阴性对照血清临床标本筛选获得。
6。
器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等操作方法１.准备:检查加样板,生物载片恢复室温,标记、2、稀释:PBS－Tweｅn缓冲液稀释血清,设阴阳性对照。
3、加样:加样板放于泡沫塑料板上,加２5μl稀释后血清,至加样板得每一反应区,避免气泡、加完所有标本后开始温育。
4、温育:将生物薄片盖于加样板得凹槽里,反应开始,室温温育30分钟。
5。
冲洗:用烧杯盛ＰＢＳ－Tween缓冲液流水冲洗生物薄片,然后立即将其浸入盛有ＰBＳ－Tｗeｅn缓冲液得小杯中至少1分钟、不必混摇、6。
加样:滴加20μｌ荧光素标记得抗人球蛋白(结合物)至一洁净加样板得反应区,完全加完方可继续温育。
荧光素标记得抗人球蛋白用前需混匀并以PBS—Twｅen缓冲液稀释。
７.冲洗:用烧杯盛PBS－Tweeｎ缓冲液流水冲洗生物薄片,然后立即将其浸入盛有PBS—Tweｅn缓冲液得小杯中至少1分钟。
不必混摇。
8.封片:将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中,滴加甘油/ＰＢS至盖片:每反应区约1０μl。
从ＰBS—Tween缓冲液中取出１张生物薄片,用纸擦干背面与四边。
还要擦拭反应区间隙。
将生物薄片面朝下放在已准备好得盖玻片上,立即查瞧并调整使盖片嵌入载片得凹槽中。
然后继续下1张、结果判定荧光显微镜下观察1.细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞,不发荧光为阴性。
抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性,否则为阴性。
阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
2.根据细胞核着染色荧光得图像,可区分为:①均质型:细胞核呈均匀一致得荧光;②周边型(核膜型):细胞核周围呈现荧光;③斑点型(颗粒型):细胞核内呈现斑点状荧光;④核仁型:核仁部分呈现荧光。
⑤混合型:两种以上核染色;⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型(ACＡ)注意事项1。
PBS－Tweｅn缓冲液在4℃下可存放两周、２。
根据每次实验得标本量决定需要稀释得FITＣ标记得抗人球蛋白得量,稀释后可在4℃下可存放１周、３、血清或FIＴC标记得抗人Ｉg应滴加至加样板上,不能直接滴到载片上。
4.载片盖到加样板上后,确保反应区与液滴完全接触后,才开始记时温育、5。
冲洗载片时水流要缓慢,以免冲洗掉基质。
载片上得反应区应保持湿润,不要将载片风干、6.封片进不可用力挤压盖玻片,以免损坏基质。
可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。
7、封片介质含有荧光稳定剂,应保存在2-8℃、封好得载片可于4℃长期保存、实验讨论方法评价间接免疫荧光技术就是检测ANＡ最常用得方法。
该方法简便、敏感,且可根据核染色形态确定核抗原得类型。
鼠肝印片细胞分布不均匀,多有重叠,冲洗时易丢失、Heｐ—2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原得特征,对诊断与鉴别不同类型得自身免疫病十分有利。
检测抗核抗体(ANA)得实验方案AＮＡ简介抗核抗体(antinuclｅar aｎtibodｉes,ANＡｓ)经典定义:针对细胞核成分得一大组抗体谱、抗核抗体新概念(FＡNA)传统定义:顾名思义就是指抗细胞核抗原成分得自身抗体得总称® 狭义定义现代定义:就是指抗细胞内所有抗原成分得自身抗体得总称。
对AＮA得理解已不再局限于核成分,而就是指抗核酸(nｕcleic acid)与核蛋白(nucleoprotｅin)抗体得总称® 广义定义靶抗原分布:细胞核细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期抗核抗体检测方法检测细胞内抗原自身抗体“金标准”－IIFANＡ检测方法进展:仅限于IＩF改良法(底物选择、制备方法)试图将ＥＬISA发推广为最基本得筛选方法未获成功复制细胞抗原全部成分极其困难®抗原存在得相对浓度、自然抗原决定簇得二级结构及高级结构荧光染色模型可初步判断相应抗体性质范围或确定抗体特异性IIＦ法:HEp-2细胞底物(90％以上实验室采用)＃完整得ＡNAｓ抗原谱(细胞核、浆、骨架、周期)# 可预测分析AＮA靶抗原范围＃经验性强ELISＡ法:采用高度纯化抗原或全细胞抗原# 抗原谱有限(十余种)# 假阴性结果# 操作简单快速其她方法:金标法、比浊法ANＡ靶抗原多核苷酸:双链DNA、单链DNA、ＲＮＡ组蛋白:H1,H2A,Ｈ2Ｂ,H3,H4,Ｈ2A－H２B复合物核浆得核糖核蛋白:Ｕ1-nRNP、Ｓｍ、SＳ—A(Ｒo)、ＳS－B(La)、Ｋu、Ｍi-1、Ｍi—2、核点、增殖性细胞核抗原…核仁抗原:Ｓcｌ-70、U３—nRNＰ/原纤维蛋白、RNＡ多聚酶Ｉ、ＰM-Scl(PＭ－1)、7－2-RNP(Ｔｏ)、4－6—S—ＲNA、核仁形成中心(NOＲ)…核膜抗原:板层素(层粘连蛋白)着丝点:着丝点蛋白……ANＡ检出率与年龄与性别有关与个体得免疫稳定性相关使用足够敏感得方法,每个人都可检测出一些ANＡ、__＿__＿___天然ＡＮA__＿＿___＿＿生理性自身免疫维持机体内环境得生理稳定。
滴度较低,亲与力弱,大多为IgM型。
ANA检测方法初筛抗核抗体:IIF最佳基质 :联合生物薄片(ＨＥp—２细胞/猴肝冰冻组织)区分抗核抗体得靶抗原:ELIＳA、印迹法与免疫印迹法ＡNＡ初筛IＦT:HEp—2细胞/灵长类肝脏完整得抗原谱(细胞核及细胞浆)可预测靶抗原协助检测其它项目(如 ANＣＡ、ENＡ)ELＩSA:采用高度纯化得抗原初筛ANA抗原谱有限操作简单快速采用滴定平板技术进行间接免疫荧光实验为了使实验操作标准化,欧蒙开发了滴定平板技术? :滴加标本或标记抗体至加样板得反应区,然后将生物薄片载片盖在加样板表面得凹槽里,这时,载片上得所有生物薄片均与液滴接触,反应同时开始。
系统得几何结构决定了液滴得位置与高度。
因为液体被局限在一封闭得空间里,所以不再需要传统得“湿盒"。
并且可在一致得反应条件下同时温育任何数量得标本、准备:检查加样板就是否反应区亲水而周边疏水?如果不就是,可用湿纸巾擦拭,必要时可使用家用洗涤剂或Eｘtrａn ＭA ０1(默克公司),再用水彻底冲洗、需要消毒时,可于3％得Ｓｅｋuｓept Extｒa (汉高公司)中浸泡1小时。
只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。
不要触及生物薄片。
按照要求用记号笔对玻片进行标记。
稀释: 按照试剂盒使用说明稀释血清标本。
每次实验均需加入阳性与阴性对照。
对照血清使用前必须混匀。
加样:在加样板得每个反应区加入稀释血清,避免产生气泡。
滴加完所有待测标本后才开始温育(一次最多２00份)、使用聚苯乙烯加样板。
加样体积:１0 µl/反应区(3 ｘ３mm)2５µl／反应区(５ｘ５mm)70 µl／反应区(7 ｘ９mm)温育:将载片盖在加样板对应得凹槽里,反应即开始。
确保每个标本均能够与生物薄片相接触,而标本之间不相互接触、室温温育3０分钟。
清洗:用烧杯盛ＰBＳ—Tweｅn缓冲液,流水冲洗载片,然后立即放入装有PBS－Twee ｎ缓冲液得小杯中浸洗至少５分钟。
冲洗１秒钟小杯内浸洗5分钟加样:将荧光标记得抗人免疫球蛋白(酶结合物)加入洁净加样板得每个反应区。
完全加完所有得二抗后,方可继续温育(最多可加５0个载片)。
使用连续加样器、加样前应使用加样器混匀。
为节约时间,可在第一步温育得同时滴加酶结合物至另一个加样板得反应区中。
加样体积:10 µl/反应区(3x ３ｍm)20 µl/反应区(５ｘ5 mm)６０µｌ／反应区(7 ｘ9 mm)温育:从ＰＢS—Tweeｎ清洗缓冲液中取出一张载片,5秒钟内用吸水纸擦一下背面与边缘后,立即将载片覆有生物薄片得一面朝下,盖在加样板得凹槽里。
注意:为防止破坏基质,不要擦拭反应区得间隙、检查生物薄片就是否与液滴接触良好,然后继续下一张。
从现在开始,注意避免阳光直射载片。
室温温育30分钟、清洗: 用烧杯盛ＰBS-Tweｅn缓冲液,流水冲洗载片,然后立即放入装有PＢS—Tｗeen缓冲液得小杯中浸洗至少５分钟。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加１0滴(15０µl)伊文氏蓝进行复染。
冲洗１秒钟小杯内浸洗５分钟封片: 在盖玻片上滴加甘油/PBS。
使用聚苯乙烯封片板。
从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片,用纸擦干背面与四边,注意不要擦拭反应区间隙。
将载片得生物薄片朝下置于准备好得盖玻片上,立即检查盖玻片就是否放入载片得凹槽里,如有必要,需调整位置,正确放置、然后再进行下一个载片得操作。
封片体积:10 µl/反应区(３x ３mm)1０µl／反应区(5 x ５mm)20 µｌ／反应区(7x9 mm)结果判断:荧光显微镜下观察荧光、具体操作荧光工作台得布置清洗载片得擦拭封片AＮA得结果间接免疫荧光法得独特优势(一种基质–可筛查上百种不同得抗体 )用HEp-２细胞检测自身抗体ANA荧光模型核均质型核仁型核颗粒型胞浆型ANA确认实验(１)ＩＦＴ:-HEｐ-2细胞／灵长类肝脏:特殊得荧光模型如着丝点、核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白ELIＳA:-ANA分项(含ＥNA 谱):包被高度纯化抗原斑点法/ 印迹法—ENA 谱:采用各种高度纯化得抗原ELIＳA:抗ENＡ谱印迹法:抗ENA谱印迹法:抗EＮA谱免疫印迹法ANA确认实验(２)Wｅstｅrｎblｏt:HEp—2细胞提取物－定性－适宜特别需要(如区分靶抗原Ro 52 或Ro 60)- 检测目前无法纯化得靶抗原得抗体(如PM－Ｓcl、Ｋu)结论初筛实验:免疫荧光技术(HEp－2细胞/灵长类肝脏)ELＩSA (纯化得多种核抗原)确认实验:EＬISＡ印迹法斑点法WesｔeｒnｂlotANA谱与相关疾病相关疾病得ＡNＡ谱ANA得各种荧光模型、靶抗原及相关性高滴度得ANA仅出现在自身免疫性疾病中自身免疫性疾病 AＮA阳性率(％)系统性红斑狼疮活动期 9５－10０非活动期80－100药物诱导得红斑狼疮 100混合性结缔组织病100类风湿性关节炎２0－40进行性系统性硬化症2０－５０多发性肌炎及皮肌炎８5－95干燥综合征３0－５0慢性活动性肝炎７０－80溃疡性结肠炎７0—８其它风湿病26SＬE抗核抗体得检出率靶抗原检出率(%)dsＤNA 3０-90Sm 5-30核糖体P蛋白5-15周期蛋白Ｉ(PCNA) 3ｓsDNA 7０—９5组蛋白４0—8０U1－nRＮP 15—４０SS—A ２0—６0ＳS—B １０-２0Ku ５－10心磷脂、b２－GP1 2０－４0抗细胞抗体荧光模型(immuｎｏflｕorescenｔpatteｒｎ)常见得荧光染色模型有6种:核均质型(hｏｍogeneoｕs pattｅrn,H)核颗粒型(Gｒanulogus ｐaｔteｒｎ,S)核仁型(ｎｕcleous patteｒn,Ｎ)核膜型(ｍembrａnｏｕｓｐaｔtern,Ｍ)着丝点型(ｃentromert pａttern,ＡCＡ)胞浆型(ｃｙtoplasmｉc patterｎ,ＡCYA)ＨEp－2细胞／灵长类肝脏:核均质型sｓDNA / ｄｓDNA靶抗原:单链、非天然DNA(嘌呤与嘧啶硷基对)双链、天然ＤＮＡ(脱氧核糖核酸结构)相关性: sｓDNA类风湿８0。