1、流动相的组成
有A液和B液两种。 A液：疏水性浓盐水溶液，并含有缓冲液作用的盐以稳定pH值。常用

的A液为1.0～3.0mol/L(NH4)2SO4加0.01～0.05mol/L磷酸盐缓冲液；
B液：稀的缓冲液，浓度与A液中的缓冲作用的盐的浓度相等。常用的
B液为0 .01～0.05mol/L磷酸盐缓冲液。
Influence of Particle Size on the Separation effect
30µ m 5µ m 15µ m
应 用
最大优点：分离度最高；
最大缺点：容易使蛋白质变性失活。
例子：人的胶原蛋白I型α1和α2键的色谱分离
3.3.2 疏水相互作用色谱
概念：用适度疏水性的配基作固定相，以盐水体 系作流动相，用疏水作用来分离生物大分子化 合物的液相色谱法，叫疏水相互作用色谱(Hyd


3.1 多肽和蛋白质药物基本知识

基本概念 多肽类药物是以多肽激素和多肽细胞生长因子为主的
一大类内源性活性成分。
蛋白质药物包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节 因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白、蛋白酶抑 制剂等，其作用方式从对机体各系统和细胞生长的调 节，扩展到被动免疫、替代疗法和抗凝血等。
色谱条件
①固定相：常用C4～ C8链烃作为配基（键合在固体基质上）为 填料。孔径25～50 nm。 ②流动相： 水溶性有机溶剂（B液） （甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃） 洗脱能力增大 ＋水（A液） ＋强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸 ）
加酸作用： ∵－SiOH == －SiO- ＋ H+
• 蛋白质易与—SiO- 结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。

3.1 多肽和蛋白质药物基本知识
细胞生长调节因子——在体内和体外对效
应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的
一类物质。
许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，
仅微量就有较强的生理活性。
生物技术在该类中的应用

基因工程技术制造------胰岛素、干扰素、白介素、生 长素、EPO等实现了工业化，发展方向为转基因动植物
一般在常温或低于常温下操作。HIC中蛋白质的保留对温度较敏感。
①在HIபைடு நூலகம்体系中蛋白质处在活性状态， T↑使蛋白质的团状结构伸展，暴
露出更多的疏水基团，疏水作用增强，保留值增大。
（其他色谱，T↑保留增大）
② T↑传质加快，使保留减小。（对所有色谱均适用）
总之，在疏水色谱中，①比②大，∴ T↑，保留增大。
疏水作用色谱的应用
例如：基因重组人干扰素r是一种基因工程
产品，其粗品是7mol/L盐酸胍溶液。

干扰素在盐酸胍溶液中处于可逆性失活 状态。因盐浓度太高无法直接上其他柱 ，除去盐酸胍后干扰素又容易析出来。

若使用疏水作用色谱柱，将此样品直接 进样，既脱除了盐酸胍，又达到了复性 的效果。而且一步分离后，干扰素纯度 可达到90%。 IFN-r粗品的HIC分离

蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大， 在分离提纯蛋白质过程中，可利用蛋白质的这一性质
除去小分子杂质——透析(dialysis)。
多肽和蛋白质的物化性质
4. 变性

天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下， 其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生 物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性， 称之为蛋白质的变性作用(denaturation)。

“疏溶剂化理论”：蛋白质与配基的结合是由于溶质分子
有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向，它们在盐水
溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。 溶质和疏水配基的结合是伴随着它们非极性表面暴露在水 中的面积的多少而进行的。

蛋白质在盐水体系中，有一倾向产生：避开水相而吸附在 固定相上。∵生物物质界面自由能比水低，与表面自由能 低的固定相产生亲合力
分离机理：
①用C4～C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相 ，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流 动相（流动相极性大于固定相）。 ②蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH 等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。
3.3.1 反相高效液相色谱
分离原理

在不同的介质中裂隙的伸展和收 缩程度不同，从而使疏水基团暴
OH OCH2CH3
露的多少也不同。

疏水色谱是利用盐水体系中样品
蛋 白 质
CH3
Ph
NH2 Ph COOH
组分的疏水基团和固定相的疏水
配基之间疏水作用力的不同而达
OH
到分离的目的。
蛋白质疏水基团分布示意图
配基和蛋白质分子之间的吸附推动力和样品组分的洗 脱机理 （即：溶质在色谱中的保留行为）：
• 减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。
色谱条件
③ 温度：常温 ④ 检测：用紫外检测器，检测波长280nm 和220nm。

280nm检测中含有含苯环的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的 蛋白质，一般蛋白质都含有苯环，所以280nm检测是普遍 使用的波长。

220nm主要检测肽键；所以所有蛋白质普遍适用。
色谱条件
⑤ 洗脱方式：梯度洗脱——逐渐增加洗脱强度。

蛋白质的分离一般就需要用梯度洗脱，否则有些蛋白质已 达到突跃会很快被洗脱下来，有些蛋白质还远离突跃区， 实际上无法被洗脱。

而有机小分子的反相色谱中未发现此种突跃现象。实际工
作中梯度洗脱时间约为20～60min，B液的变化速度约为每
分钟5%～15%。
1. 酸碱性 多肽是小分子，化学性质与氨基酸类似，含有 20个以上氨基酸残基的多肽与蛋白质没有明显 界限； 蛋白质是呈两性解离的电解质，通常在等电点 时，蛋白质的溶解度最小，不稳定，易于从溶 液中沉淀析出。 各种蛋白质分子都有自己的等电点。

多肽和蛋白质的物化性质
2. 离子结合

蛋白质存在两性，其表面带有一定量的电荷，
rophobic Interaction Chromatography,HIC)或
疏水作用色谱。
分离原理

在HIC中：固定相表面有疏水性基团，（如-CH2，CH3 ，-ph等）。

蛋白质分子是一个外部有亲水层包围，内部有疏水核的 具有四级结构的复杂体系。

蛋白质表面亲水性很强，但也有一些疏水性的基团，同 时团状的蛋白质还存在疏水基团较多的裂隙。

加拿大渥太华大学生物技术研究中心的科研人员也利
用另两种高产作物——烟草和水稻植株生产出了一种
名为“胰岛素样生长因子”(ILGF)的新型降血糖药物
。

据称，ILGF的降糖效果甚至优于常规口服降糖药。
如果ILGF能通过临床试验并成功上市，或将成为前景
可期的国际医药市场畅销产品。
3.3 多肽和蛋白质药物的分离
产油料作物——红花作为转基因植物“平台”，成功生
产出“红花子来源人胰岛素”，

该胰岛素顺利通过动物实验与Ⅰ～Ⅱ期临床试验，其药 代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表 述胰岛素基因生产的重组DNA人胰岛素基本一样。

理论上，每公顷红花田可生产出1公斤人胰岛素原料药。
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
硬基质：主要是大孔径硅胶。 配基：是一些含氮和氧原子的中等疏水性基团； or是丁基、苯基这些疏水基团键合在一个亲水性表面。
色谱条件
主要有： a. 具有中等疏水性表面的填料；
b. 盐析性盐的水溶液为流动相；
c. 紫外检测器检测，检测波长220或280nm； d. 流动相pH值接近中性； e. 由高盐浓度到低盐浓度的梯度洗脱，梯度时间20～60 min； f. 常温或4℃下操作。
按来源分
生化药物——来源于动植物有机体 基因工程药物——来源于基因工程菌表达生产的 药物

习惯分法
多肽生化药物、细胞生长因子、抗体药物、抗菌 肽、酶类药物
生化药物
多肽类激素、多肽抗生素：消化道多肽、下丘脑 多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。
酶类与辅酶类药物：蛋白水解酶类、凝血酶及抗 栓酶，辅酶Q10等。
蛋白质、多肽提取分离常用的方法：


沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、结晶等） 超滤法 膜分离法 离心分离法 凝胶过滤法 离子交换层析 疏水相互作用色谱 亲和层析等
基因工程药物分离与纯化的流程
3.3.1 反相高效液相色谱
3.3.1 反相高效液相色谱
3.3.1 反相高效液相色谱
Chapter 3 多肽与蛋白质类药物

1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽——催产素 以后，20世纪50年代都集中于脑垂体所分泌的各种多 肽激素的研究。 60年代，研究的重点转移到控制脑垂体激素分泌的各种 多肽激素的研究。 70年代，神经肽的研究进入高潮。生物胚层的发育渊源 关系表明，很多脑活性肽也存在于肠胃组织中，从而推 动了肠胃激素研究的进展。
盐有两类。 盐析性盐：使蛋白质的构象稳定，会促进蛋白质自身间的疏水作用而

析出，or促进蛋白质与配基之间的疏水作用而保留在柱上。不失活， 溶解度减小。常用： (NH4)2SO4
盐溶性盐：提高蛋白质的水溶性，同时会使蛋白质变性。如硫氰酸盐
、盐酸胍等会。
1、流动相的组成
2、流动相的pH值：一般地pH 4～8 ；常选 pH 7左右。 3、温度

利用基因工程技术构建工程菌（细胞）进行生产 利用原核生物或简单的真核生物如酵母菌作为工 程菌（活细胞），通过将含有编码某蛋白或多肽的碱 基序列插入一段DNA载体（如质粒）中，并在工程菌
（或细胞）中表达，从而得到相应的多肽或蛋白质。