石蜡切片基本步骤（一）取材和固定根据实验目的选择材料。

将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。

取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。

固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。

固定时间：4ºC固定24小时。

注意事项：取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。

夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。

取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。

2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。

3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。

4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。

固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。

否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。

2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。

真空泵抽气或者用空针管抽气。

昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。

3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。

勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。

4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。

5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。

（二）洗涤2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10minBouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。

甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。

但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。

陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。

否则会影响以后的染色效果。

（三）脱水与透明漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。

每级10min。

脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。

注意：1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。

2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。

动物组织每级10~30min。

3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。

（四）透蜡透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。

便于今后的包理与切片。

1. 新蜡应多次熔化，使其中所含的挥发性物质蒸发，杂质沉淀，以免包埋时出现蜡花。

2. 透蜡时必须经过数次纯石蜡，使其中剩余的二甲苯完全去尽。

3. 透蜡温度要恒定，保持石蜡溶化状态，不可忽高忽低；4. 动物材料常用的石蜡熔点为52-56ºC；植物材料为54-60ºC。

5. 为了使石蜡完全渗透，每隔一小时抽气一次。

（五）包埋纸盒包埋法：1. 包埋前准备好纸盒、金属温台（或者水浴锅代替）、镊子、酒精灯、粗解剖针及熔化的石蜡等。

2. 点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，在纸盒一边写好标签。

3. 先将纸盒放在温台上，然后将已熔化的石蜡倒入纸盒中，并取镊子或解剖针放在酒精灯上加热插入盒中，沿纸盒的边缘轻轻移动，以除去石蜡中的气泡，此时，可将纸盒从温台上取下，放在准桌子上。

4. 待纸盒底部石蜡凝固成一薄层时，将材料用已加热的镊子移入纸盒内，并迅速将材料按需要的切面排好。

5. 待石蜡表面凝固一薄层时，用双手平稳将纸盒放入冰水中，等到表面已凝固后，将纸盒压入水中，使石蜡迅速凝固。

6. 蜡块完全凝固后即可取出包埋模包埋法：1.将包埋底模存于烤箱的下层(或单独的一层)。

2. 根据组织块大小选取包埋底模，用镊子在酒精灯上加热，夹取组织块放于底模内，上覆装组织脱水的写有该组织块编号的一次性包埋盒，倾倒石蜡少许，以不溢出为宜，稍置片刻。

3. 把冰箱冷冻室内的冰盒取出,将包埋好的蜡块,放于冰盒冷冻片刻（约5min-10min），冬季时间短。

1.镊子要随用随烤热，以免石蜡凝结在镊子上，造成蜡块凝固不均匀2.包埋过程要迅速，组织从蜡杯中取出的时间要尽量缩短3.包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如出现白色浑浊，应考虑：脱水不彻底；包埋蜡温度低，过早凝固；石蜡不纯4.包埋箱的温度必须保持恒定5.包埋不理想应重新将蜡块熔化，重新浸蜡和包埋6.尤其在用纸盒包埋时，蜡块表面冷却后必须放入冷水中使其迅速凝结为蜡块（六）修块在标本蜡块进行切片之前，要把包埋好的蜡块用刀片修整为可以用来切片的标本蜡块，修成规整的方形或长方形，切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。

1. 分块：用单面刀片轻轻地在包埋的蜡块表面划直线分割，稍用力掰开。

2. 粘块：先用碎蜡将包埋盒填满，然后将刀片在酒精灯火焰上加热，加热的刀片迅速在蜡块和包埋盒之间一抹，使蜡块底部的石蜡融化而粘附在包埋盒的石蜡上。

3. 修块：（1）用单面刀片依据标本形状在蜡块表面轻轻划出标本四周保留的石蜡范围,大约周边预留1-2 mm宽度；（2）将单面刀片加热，将范围之外多余的石蜡逐渐融化。

蜡块切面应修整为近似的正方形和长方形，从蜡块的侧面观察应为梯形。

注意事项：蜡块四边的石蜡要用单面刀修成两两平行的直线，尤其是要与切片刀平行的那两边更为重要，否则会造成切片时所切下的蜡带向一侧弯曲。

蜡块形状要与其内的标本形状相匹配。

（七）切片前准备工作1.载玻片的处理（1）首先将载玻片浸泡在清洁液中12～24小时（利用染色架和染缸）；（2）将载玻片从清洁液中取出，自来水流水充分冲洗，1～2小时，使其表面的洗液成分被流水冲净；（3）将载玻片浸在蒸馏水中，漂洗三次，每次10～20分钟；（4）将载物片放入烤箱烤干，或用棉布逐个将载玻片擦干，装盒备用。

清洁液配制方法：重铬酸钾1份（g），浓硫酸1份（ml），蒸馏水10份（ml）常规的玻璃制品的清洁。

将重铬酸钾溶于蒸馏水，可以加热使其完全溶解，冷却后，缓缓加入浓硫酸，边搅动边加入硫酸，由于硫酸的加入可产生大量的热量，洗液配置的容器一定要耐热，否则容器因过热容易爆裂。

在配制过程中，不许将蒸馏水倒入浓硫酸中，会引起溶液的剧烈反应，造成伤亡。

注意洗液只能用于玻璃仪器的清洁，不能浸泡金属器械，因为洗液对金属有腐蚀作用，另外，在洗液内浸泡载薄片时使用塑料篮子盛放的，也要注意洗液对塑料是否有腐蚀作用。

注意事项：在收取烤干的载物片以及其装盒收藏的过程一定要戴上手套，因为手指表面上的油脂可污染载物片的表面，会影响载物片的清洁度，影响涂片制作的质量。

2、盖玻片的清洁盖玻片在清洁液中浸泡1～2小时，流水冲洗1小时左右，注意要经常搅动盖薄片时，使酸的成分被充分洗净，但搅动的动作不得过大，否则造成盖薄片的损伤，蒸馏水浸洗2～3遍（5～10分钟），95％酒精浸泡5～10分钟，用绸布将其擦干，分类装盒备用。

3、蛋白甘油（1）将鸡蛋打孔，取出蛋清，放入量筒中；（2）加入等量体积的甘油充分混合，此时产生很多泡沫，静止半日使泡沫上升到液面，倒去此部分或用双层纱布过滤即可。

（3）倒入无水无油的棕色瓶内，加入几粒麝香草酚（或苯酚），稍加晃动即可。

配制好的蛋白甘油液放置于4℃冰箱内保存，有效期一年。

使用方法：在洁净的载玻片上滴一滴蛋白甘油（用≤5mm直径的玻璃棒），用洁净的小手指涂匀，放在晾片板上备用（4）烤片台加入蒸馏水，加热到42-45ºC。

（八）切片操作步骤1. 切片前，将蜡块放在冰盒中预冷；2. 将预冷的蜡块装在切片机固定器上，调整到稍离开切片能够切到的位置上，注意蜡块组织切面与切片刀口要垂直平行，再装切片刀；3. 调整切片刀与组织块平面的倾角关系，一般为10-15度角4. 根据需要调整切片厚度，一般情况石蜡切片厚度为5～7um。

对于特殊要求的石蜡切片，其切片厚度可在2～4um，或8～12um5. 摇动切片机手轮先进行修整切片，直到切出完整的最大组织切面后，再进行切制。

6. 切片时，左手持毛笔，右手转动轮盘，轮盘转动应匀速行进，手的用力要均匀。

当转动三、四次轮盘后，刀刃处存有较短的石蜡带，左手持毛笔轻轻转动托住切下来的蜡带，并慢慢向外抻拉，随着石蜡带的加长，毛笔托着石蜡带缓慢向后移动，与此同时，右手不断地摇动轮盘。

注意：左手移动的力量不可过大，操作中始终不要将石蜡带抻拉太紧，否则会使切下来的石蜡带断裂。

7. 当取下石蜡带时，应及时锁住切片机的轮盘开关，右手持解剖刀替换毛笔上的蜡带，用毛笔笔尖从石蜡带后面从下向上扫刀刃，同时，托住石蜡带的另一端缓慢放在干净的纸上。

操作应注意：1. 所切下的蜡带有反正面之分，与刀刃接触的蜡带面为反面，表面有光泽，应将其面放在纸上，要始终保持将石蜡带正面朝上。

2. 切片操作中切片的速度要均匀，尤其是标本蜡块经过切片刀刀刃的一段过程，不可忽快忽慢，切忌有停顿的现象。

3. 放在纸上的石蜡带要注意保存好，由于石蜡带很薄又很轻，极易受到外界的微小力量而吹散，尤其是在进行连续切片时。

4. 切下来的石蜡带应及时进行展片，存放时间越长，展片的质量就越差。

(九) 展片与烤片将一定长度的蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片粘附于载玻片上，从展片台水浴锅中吸取温水（45℃左右）从玻片一端缓慢滴加，蜡带随着水流逐渐展平；展平后用滤纸吸除多余水分。

将载玻片放入展片板上，45℃温箱中干燥，也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。

注意：石蜡切片必须烘干，否则在以后的染色过程中会发生脱片。

（十）HE染色注意事项：（1）二甲苯脱蜡：脱蜡时间和室温高低有一定关系，室温高，脱蜡时间可短些，反之时间就要延长。

脱蜡必须彻底，室温过低时可放入温箱中脱蜡，否则，脱蜡未尽会影响下一步的进行。

（2）苏木素染色：染色时间应根据室温的高低、染色液的新旧、组织结构的差别、固定液的不同而有所区别。

如室温高，染色时间可短些，冬天室温过低时，也可放入温箱中进行。

染苏木素时，可以深染一点，以后分色时，在盐酸酒精中多停留一会，即深度重褪。

切片从苏木素取出后为深紫色。

（3）自来水浸洗：如自来水（流水）中冲洗10min左右，使切片颜色转至深蓝色为止。