原则上, 所有的高通量测序技术都能进行RNA测序。自2019 年以来, 以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的 Solexa 技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测 序技术相继诞生, 之后HelicosBiosciences 公司又推出单 分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术。新一 代测序又称作深度测序或高通量测序, 是相对于传统的 Sanger 测序而言,主要特点是测序通量高, 测序时间和成 本显著下降。各平台测序原理及序列长度的差异决定了各 种高通量测序仪具有不同的应用侧重
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景
1、虽然RNA-Seq 技术还面临着种种困难, 但 作为一个刚刚起步的新技术RNA-Seq 已经显 示出其他转录组学技术无可比拟的优势：既 能提供单碱基分辨率的转录组注释又能提供 全基因组范围的“数字化”的基因表达谱, 而 且其成本通常比芯片和大规模的Sanger EST 测序要低, 有
Procedure of RNA-Seq
Total RNA
Rich mRNA (polyA RNA)
Oligo(dT) primed cDNA synthesis
Random hexamer primed cDNA synthesis
RNA fragment (200~700 nt)
Fragmentation (200~700 bp)
转录组？
转录组是特定组织或细胞在某一发 育阶段或功能状态下转录出来的所 有RNA 的集合
RNA-Seq 原理
把高通量测序技术应用到由mRNA 逆转录生 成的cDNA 上, 从而获得来自不同基因的 mRNA 片段在特定样本中的含量, 这就是 mRNA 测序或 mRNA-Seq, 同样原理, 各种 类型的转录本都可以用深度测序技术进行 高通量检测, 统称作RNA-Seq
RNA-Seq 面临的挑战
庞大的数据量所带来的信息学难题
如何针对更复杂的转录组来识别和追踪所有基 因中罕见RNA 亚型的表达变化
目前的高通量测序技术大都需要较多的样品起 始量, 这使得来源极为有限的生物样品分析受 到限制, 因此如何对单细胞或少量细胞进行转 录组测序是一个亟待解决的问题
2、就目前来看, 作为两个高通量的转录组 学研究技术, 在应用的某些方面既存在重叠 和竞争也存在优势互补, 一种技术能弥补另 一种技术遗漏的部分, 通常对一个生物学问 题的回答需要不同实验技术的协同配合
3、 RNA-Seq 的强项, 就在于它是一个“开 放系统”, 它的发现能力和寻找新的信息的 能力从本质上高于芯片技术, 相信随着相关 学科的进一步发展和测序成本的进一步降 低, RNA-Seq 必将在转录组学研究领域占 主导地位
������）扩增 4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx） 5. 数据分析
������ 原始数据读取
������ 与数据库比对并进行注释
������ 深层次数据分析
RNA-Seq 的应用领域
图所示 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行 基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及 非编码RNA，比较样本间的表达水平差异
RNA-seq常见问题
• 送样要求： 浓度≥400ng/ul，RNA总量≥20ug；OD260/280为1.8-2.2， 28S/18S＞1.8，RIN ≥8.
• 在进行原核生物转录组分析时需要提供纯化后的原核生物 mRNA或cDNA样品。
• 进行非编码RNA测序时需要提供去除rRNA和tRNA的RNA样品。 • 测序1Gb的转录组数据时通常可以得到长度大于500bp的