文献综述生物工程纤维素酶的概述【摘要】纤维素作为地球上分布广，含量丰富的碳水化合物，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。
纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机，粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。
本文就纤维素酶的应用进行一个简要的概述。
【关键词】纤维素酶；纤维素酶的实际应用：应用前景1. 纤维素的概况1.2 纤维素酶的分类纤维素酶的组成比较复杂,通常所说的碱性纤维素酶是具有3～10 种或更多组分构成的多组分酶。
根据其作用方式一般又可将纤维素酶分为3 类: 外切β- 1, 4-葡聚糖苷酶( 简称CBH) 、内切β-1, 4- 葡聚糖苷酶( 简称EG)和β- 1, 4- 葡萄糖苷酶( 简称BG) [1]。
在这3 种酶的协同作用下,纤维素最终被分解成葡萄糖。
到目前为止, 还没有能够在碱性条件下分解天然纤维素的纤维素酶。
碱性纤维素酶是一种单组分或多组分的酶, 只具有内切β- 1, 4- 葡聚糖苷酶( 又称CMC酶) 的活性, 有的还与中性CMC 酶组分共存[2]。
1.3 纤维素酶的作用机理纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时, 可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质, 有利于动物胃肠道的消化吸收[3]。
同时, 纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌, 补充内源酶的不足, 并对内源酶进行调整, 保证动物正常的消化吸收功能, 起到防病、促生长的作用, 消除抗营养因子,促进生物健康生长。
半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液, 增加消化物的粘度, 对内源酶造成障碍, 而添加纤维素酶可降低粘度, 增加内源酶的扩散, 提高酶与养分接触面积, 促进饲料的良好消化。
而纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物, 在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物, 从而使消化道内的消化作用得以顺利进行[4]。
也就是说纤维素酶除直接降解纤维素, 促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外, 还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化[5]2. 纤维素酶的一些历史及研究成果在吴琳,景晓辉,黄俊生[3]的产纤维素酶菌株的分离，筛选和酶活性测定中，他们利用“采样—培养—分离单菌落—初筛—复筛—测OD值”的方法筛选出分解纤维素能力较强的菌株。
[结果]经反复培养和划线分离从80份样品中初选出35株具有分解纤维素能力的菌株。
其中10株由白转绿,长势较好;6株深绿色,长势一般;4株绿色,长势较好。
这20株都产孢子,被初步鉴定为绿色木霉。
用刚果红培养基进行复筛选,得到9株透明圈较大的菌株。
将这9株菌株再进行发酵培养,用DNS法进行酶活测定得到2株酶活较强的菌株。
这2株菌株被鉴定为棘孢木霉。
通过滤纸崩解测试筛选出20株降解纤维素能力较强的菌种。
DNS法酶活测定结果表明采自甘蔗堆积处和甘蔗地的2个菌株的产酶活性最高。
得到的结论采自甘蔗堆积处和甘蔗地的2个菌株可以作为降解纤维素的新菌种[7]。
在苏贝，韩峰，于文功（中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室山东青岛266003）海洋细菌Cellulophaga sp. QY201 产内切纤维素酶发酵条件的研究中，研究人员采用的材料及方法：测酶活用羧甲基纤维素钠（CMCNa）购自Fluka；酸水解干酪素购自北京鼎国（Genview 分装）；蛋白胨、酵母提取物购自上海生工；其它试剂均为国产分析纯。
TB-12R-3F 振荡摇床为日本Takasaki Scientific Instruments Co. 产品；J2-MC 冷冻离心机为Beckman 公司产品。
唯一碳源基础培养基组成如下：（w/v）CMCNa 0.3 %, NaCl 3 %,（NH4）2SO4 0.2 %, Na2HPO4 0.15%, NaH2PO4 0.1 %, 100 kPa 灭菌15 分钟。
粗酶液的制备：不同发酵条件下的发酵液经10000 r/min 离心10 min 后，上清液即为粗酶液。
纤维素酶活力测定：取0.9 mL 1 %（w/v）CMCNa 底物（0.02 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲液配制）加入0.1 mL 酶液，在50 ℃下温育10 min,迅速加入1 mL DNS 试剂，沸水浴5 min 后，迅速冷却，加5 mL 蒸馏水，于520 nm 下测定吸光值。
用100℃灭活5 min 的酶液作对照。
在此条件下，每分钟产生1 μmol还原糖的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
他们得到结论经发酵条件优化，确定海洋细菌Cellulophaga sp. QY201产纤维素酶的最佳培养基配方为（w/v）：CMCNa 0.5 %，CaSein0.3 % ，NaCl 3 % ，MgSO4·7H2O 0.3 % ，Na2HPO4 0.15 % ，NaHPO4 0.1 %，pH=7.0。
最适培养条件为：500 mL 三角瓶装液150 mL，温度28℃，转速100 r/min,发酵时间36 h。
优化后发酵液上清的酶活最高可达7.85 U/mL，约为优化前的3.5 倍。
在发酵优化过程中发现，菌株Cellulophaga sp.QY201生长及产酶对NaCl 和Mg2+ 有一定的要求，表明了其海洋微生物的特性。
经过优化所得的发酵培养基和培养条件使产酶量大幅度提高，且稳定性好，为纤维素酶的大规模制备以及以后的分离纯化和性质研究工作奠定了基础[8]。
在孔凯,孟宁,冯琳,李师翁(兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070)产纤维素酶细菌的分离鉴定及产酶特性研究里。
他们利用刚果红染色鉴定法用接种针将斜面单菌落转移到复筛产酶培养基,25℃恒温培养3 d,向培养皿中加入适量1 mg/mL的刚果红溶液,染色1 h后,用1 mol/L的NaCl溶液洗脱.得到的结果是菌株的分离纯化与筛选从取自青藏高原的一份牦牛粪材料中,经稀释涂布平板分离到能在以CMC为唯一碳源的培养基中生长的菌株6株,用刚果红染色,产生透明圈直径较大的菌株有一株,给该菌命名为Tibet-YD5000-3.Tibet-YD5000-3菌落为橙黄色,圆形边缘整齐,菌落表面为低凸面.革兰氏染色表明Tibet-YD5000-3为杆状革兰氏阴性菌.他们结论是纤维素是地球上最丰富而可再生的生物聚合物。
经初步统计，已发现的具有降解纤维素能力的微生物有近200 种，分布在真菌、细菌和放线菌中。
现今分泌降解纤维素酶微生物的研究主要集中在陆生菌，且集中在丝状真菌的研究上，对海洋菌的研究较少[8]。
在很多平板降解圈直接分离法分离CMCase 菌株的方法中，以刚果红法为最好。
其它的方法有的受底物来源的限制，有的灵敏度低需培养较长时间，有的则因杀死菌体而需用影印移植，这就造成很多不便。
运用CMC平板、透明圈法和滤纸崩解法从青藏高原牦牛粪中分离到可产生胞外纤维素酶的黄杆菌属.菌株Tibet-YD5000-3.实验表明, Tibet-YD5000-3最适生长温度为20℃,最适生长pH值为8.0.Tibet-YD5000-3菌株最适产酶温度25℃,最适产酶pH值为8.0.Tibet-YD5000-3所产纤维素酶反应最适pH值为8.0,最适反应温度30℃,经测定该菌株最适培养条件、酶最适反应条件下测得纤维素酶活为12 U/mL,具有进一步开发应用的前景.目前对黄杆菌属细菌的研究相对较少,最近的研究发现,该属细菌具有产褐藻酸酶等活性,尚未发现该属细菌具有产纤维素酶活性,我们的研究首次分离到一株产胞外纤维素酶的黄杆菌属菌株Tibet-YD5000-3,有必要对该细菌的纤维素酶基因进行分离鉴定和更深入地研究[9]。
在王全，李术娜，李红亚，雷白时，陈妍，张立静，朱宝成（河北农业大学生命科学学院，河北保定071001）的产芽孢纤维素降解细菌XN-13 菌株筛选及酶活力测定。
他们试验的时间与地点：试验于2008 年在河北农业大学生命科学学院制药工程系微生物研究室进行。
他们使用的实验材料：新鲜牛粪，取自河北农大牧场健康奶牛直肠或粪便。
他们配制的培养基：NA培养基、NB培养基、CMC-Na 培养基、刚果红纤维素钠培养基见《微生物学实验》。
生理生化鉴定培养基及试剂见《常见细菌系统鉴定手册》。
研究人员使用的试剂是0.05 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液；3,5-二硝基水杨酸显色液（DNS）；0.5%羧甲基纤维素钠溶液；0.2 mg/ml纤维素酶；2 mol/L盐酸溶液；72%硫酸溶液；中性洗涤液。
他们使用的方法：（1）取新鲜牛粪10.0 g 于试管中，在水浴锅内80 ℃水浴10 min，杀死菌体。
（2）称取5.0 g 处理过的牛粪，于150 ml NB培养基中170 r/min，37 ℃培养48 h。
将培养后的发酵液进行梯度稀释，依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
分别取稀释到10-4、10-5、10-6的发酵液20~30 μl到刚果红纤维素钠平板中，三角刮涂布，37℃恒温箱中倒置培养48 h。
（3）观察平板，标记出圈的菌种、测量水解圈直径并记录试验结果。
复筛初筛所得菌株在液体发酵培养基中进行发酵，考察发酵代谢产物的降解活性。
一方面按初筛方法考察发酵上清液的产酶能力；一方面定量测定发酵上清液酶活。
将初筛得到的菌株扩培，转接到NB培养基上，置于37 ℃恒温培养24 h 以活化菌株。
将活化后的菌株接种至复筛液体发酵培养液中，37 ℃静置培养48 h后，以10 000 r/min，4 ℃离心5 min，取上清液点样于刚果红平板的微孔，每孔点样100 μl。
37 ℃避光培养5天后观察并记录脱色圈的有无及大小。
他们做的纤维素酶活力的测定：（1）CMC酶活力测定。
酶活力（U/ml）=OD×H×N×2×1000/30。
是H—标准曲线系数，N—酶液稀释倍数，2—换算成每毫升酶液，1000—葡萄糖毫克数换算成微克数。
精确称取分析纯无水葡萄糖100 mg，溶于蒸馏水中，定容至100 ml。
将初筛的菌种分别接种于不含葡萄糖的NB培养基中170r/min，37 ℃培养48 h。
分别吸取各个菌种的发酵液1 ml 于EP 管中，10 000 r/min离心10 min后上清液即为粗酶液。
在试管中加入1.0 ml 0.5%羧甲基纤维素钠溶液，1.0 ml 0.2 mg/ml 纤维素酶液，于50 ℃反应30 min 后，加入DNS试剂终止反应，沸水浴5 min，于550 nm比色并记录实验结果。
以光密度为纵坐标，含糖量为横坐标，绘制标准曲线。
他们做的菌株降解能力测定：取1.0000 g 样品置于烧杯中，加入2.0 mol/L HCl，70 ml 之后放入高压蒸汽灭菌锅，100 ℃保温50 min。