鼠伤寒沙门氏菌：组氨酸营养缺陷型 埃希氏大肠杆菌：色氨酸营养缺陷型 • 菌株特性鉴定
菌株
TA 1535 TA 1537 TA 98
组胺酸 缺失 突变 修复 LPS VIT G 46 urvB- rfa- bioC3076 urvB- rfaD3052 urvB- rfabiobio-
质粒 ----pKM101
化学物质直接与DNA相互作用
• 碱基类似物取代：如5-溴脱氧嘧啶核苷化学结构：如亚硝酸能
使腺嘌呤和胞嘧啶发生脱氨基作用；
• 碱基烷化形成加合物：主要烷化剂包括烷
基硫酸酯（如甲基磺酸甲酯）、N－亚甲基 化合物（如二甲基亚硝胺）、环状化合物
（如氮芥）以及卤代亚硝基脲4类。
TK -/- cells (TFT resistant & THMG sensitive) TK +/- cells (L5178Y, TK6, WTK1) treated by chemicals, and then selected by TFT (trifluorothymidine) The growing colony — TFT resistant ( TK -/- ) mutant
Spontaneous reverse mutation (selected by THMG medium)
L5178Y-3.7.2 cell line （ tk +/- ）
TK +/- cells (TFT sensitive & THMG resistant) Mutagen treatment
Target cell：Mouse lymphoma L5178Y tk +/- 3.7.2C cell line ( D.Clive & P.Voytek. Mutat Res, 1977 )
L5178Y-3 cell line （ tk +/+ ）
EMS treatment
L5178Y-3.7 cell line （ tk -/- ）
和染色体结构畸变）和非DNA为靶的损伤
（染色体数目畸变，包括整倍体和非整倍
体改变）；
基因突变
• 定义：基因在结构上发生了碱基对组成和 排列顺序的改变； • 基本类型： 碱基置换（base substitution） 移码突变（frame shift mutation）
大段损伤（large segment damage）
培养基
• 不含马血清的RPMI1640培养基
染色体畸变
• 包括染色体结构畸变和染色体数目畸变；
• 在观察细胞中期分裂相时可以看到； • 基本类型为断裂，能诱发染色体断裂的物 质称为断裂剂；
染色体结构畸变
• 染色单体型 • 染色体型
类型
• 裂隙（gap） • 断裂（break） • 缺失（deletion），断片，微小体 • 环形染色体（ring chromosome）或无着丝粒环 （acentric ring） • 倒位（invertion）
可检测的 突变类型
碱基置换 移码 移码
TA 100
G 46
urvB- rfa-
bio-
pKM101
pKM101
碱基置换
碱基置换
WP2uvrA tryp E uvrA
-
剂量设置
• 阴性对照组/溶剂对照组；
• 受试物至少五个剂量组； • 阳性对照组；
方法
• 平板掺入法：
1）0.1 mL受试菌液；
2）0.1 mL受试物、溶剂对照或阳性物溶液； 3）0.5 mL磷酸钠缓冲液/S9混合液； 4）2.0 mL融溶的顶层琼脂 （0.6％琼脂、0.5％ NaCl、0.5 mM生物素和0.05mM L－组胺酸 ） 混合后，铺于底层琼脂上，室温凝固。
• DNA嵌入分子链：如某些多环烃的环氧化 合物。
有丝分裂毒物
• 不直接作用于DNA，而是作用于纺锤体、
中心粒和其它核细胞器，干扰有丝分裂，
间接诱发染色体畸变。
DNA损伤的修复
• DNA具有自身修复能力，清除受损的DNA
片断，合成新的片断来替换；
• 修复过程依靠酶（核酸内切酶和外切酶，
以及DNA聚合酶）
DNA损伤的修复
• 复制前改正错误（损伤逆转和切除修复）；
• 复制时避免错误(DNA聚合酶和3’,5‘－核酸外切
酶）；
• 复制后避免错误； • 复制后DNA修复。
遗传毒性的危害
DNA损伤 体细胞突变 （胚胎接触） 修复效率 生殖细胞突变
良 性 肿 瘤
恶 性 肿 瘤
细 胞 衰 老
已分化 的胚胎 细胞受 损
伤
• 自发突变率高，需要定期清除自发突变。
Thymidine Kinase (TK): 233 amino acids Coded by the autosomal tk gene tk gene: Situated at the distal end of the q-arm of chromosome 11 (mouse) or chromosome 17 (human) Size of tk gene: 11 kb with 5 introns tk locus mutation: tk+ tk- allele caused by T G transversion at position 489
• 遗传损伤
1.姐妹染色单体交换试验（SCE） 染色体同一位点上DNA复制产物的互换，
可能与DNA断裂的复合有关。主要发生在
DNA合成期，可以表示细胞在S期受损后修 复的程度。
2 程序外DNA合成试验
程序外DNA合成指细胞内由DNA修复系统
进行的DNA合成。可检测受试物引起DNA 损伤、启动修复机制的能力。
程中的伴随现象，来确定化学物质产生遗
传物质损伤并导致遗传性改变的能力。
一般原则
• 目的：识别人群接触的诱变剂并确定其危 险度。评价化学物质对生殖细胞的损伤，
引起下一代的健康危害。
• 方法学原则：应用不同范围，不同观察终 点（基因和染色体水平）的一组试验方法 来评价。
常用遗传毒性测试方法
• 基因突变
自发突变和诱发突变
• 自发突变：由于普遍存在的未知因素的作用下，
在自然条件下发生的突变；特点是发生过程长，
频率低，与物种进化有关；
• 诱发突变：由已知的某种化学、物理和生物等因
素所引起的突变，特点是发生过程短，频率高，
对人类造成不可逆的危害；
• 诱变性（Mutagenicity)：化学物质或其它环境 因素引起的遗传物质发生突变的能力。 • 致突变作用（Mutagenesis）：化学物质和其 • 诱变剂（Mutagen）：能引起生物体遗传物质
它环境因素引起生物体遗传物质的致突变效应。
发生改变的化学物质或任何环境因子，也称为
遗传毒物。
• 直接诱变剂：化学物质或环境因子本身就
能引起突变的；
• 间接诱变剂：化学物质本身不能引起突变， 必须经过体内代谢活化成活性代谢产物后，
才能具有致突变性。
诱发突变的类型
• 遗传终点－－基因突变（gene mutation） 和染色体畸变（chromosome aberration）； • 作用机制－－DNA为靶的损伤（基因突变
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames）
哺乳动物细胞基因突变试验（TK，HGPRT) 果蝇伴性隐性致死试验（检测果蝇X染色
体上的隐性致死性突变）
• 染色体畸变 染色体畸变试验 微核试验
显性致死试验（显性致死是精子发生过程中多个
染色体断裂引起的杂合子死亡，可用于检测受试 物对整体哺乳动物生殖细胞遗传损伤作用，观察 胚胎死亡情况）
内重复： ABC DEFDEF GHIJ
放大：ABCDEFGHIJ ABCDEFGHIJ ABCDEFGHIJ ABCDEFGHIJ
倒位： ABC FED GHIJ
正向突变和回复突变
• Forward mutation：
野生型→突变型 • Back/reverse mutation： 突变型→野生型
3 测试DNA加合物
大多数化合物在体内代谢产生的活性中间
产物具有很强的化学活性，常与大分子发 生共价结合，形成DNA加合物，其有不同
的分布特征，常用于肿瘤的生物标记物。
新药安全评价中遗传毒性试验的标准组合
• 细菌回复突变试验
• 小鼠淋巴瘤细胞突变试验/染色体畸变试验 • 微核试验
Ames试验
• 测试系统：细菌
• 包括代谢活化和非代谢活化条件
• 在处理后24和48小时收获细胞 • 代谢活化条件下，受试物处理时间为3小时
读片分析
• 有丝分裂指数－毒性
• 染色体结构畸变 • 染色体数目畸变
小鼠淋巴瘤细胞突变试验（MLA）
• 试验系统 小鼠淋巴瘤L5178Y TK+/-细胞 • 既能够检测点突变，也能够检测出大的染色体损
• 预培养法
将下列物质在冰浴上混合： 0.5 mL S9混合液或0.5 mL磷酸缓冲液 0.1mL过夜培养菌液（大约108菌量） 0.01 mL受试物溶液（或对照，溶剂和阳性对照 物溶液） 将该混合液在37℃下培养20分钟（水浴中）。 然后加入2mL含有0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5 mM 生物素和0.05mM L－组胺酸的融溶顶层培养基， 铺至基础培养琼脂表面（V-B培养基E），在室温 下凝固。
代谢活化系统
• 大鼠肝S9混合液
• S9制备方法：取5只雄性大鼠，处死大鼠的前5天
单次腹腔注射给予500 mg/kg的Aroclor 1254。处
死，放血，无菌取肝组织，匀浆，经9000g离心10
分钟后的上清液部分为S9。将S9分装成2-4mL/管，