小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）
基本方法
❖ 软琼脂平皿法（soft agar method）在美国使用较多。在平皿中生长 的抗性突变细胞集落呈近似正态分布，根据实验结果可计算克隆效率 （cloning efficiency，CE）和突变率（mutation frequency，MF）等 指标。
❖ 微孔平板（microwell method） （即96孔培养板）法在欧洲使用较 多。在微孔中生长的抗性突变细胞集落呈Poisson分布，根据实验结 果可计算接种效率（plating efficiency，PE）和突变率等指标。
• 2008. 11
胞毒性提出异议
未按期开会（未获 • 2011.11 得彗星试验数据） S2(R1)正式颁布
ICH S2A+S2B=S2(R1)
S2R1 的修订宗旨： ✓减少体外哺乳动物细胞试验的假阳性 ✓动物试验 3R原则（替代、减少和优化）
In vivo： 建议整合入重复给药毒性实验中 每次实验不必使用平行的阳性对照 应用流式细胞仪检测
32 染色体畸变试验(CA)
❖ 测试系统 哺乳动物细胞：CHL, CHO 人外周血淋巴细胞 ❖ 细胞核型
染色体畸变试验
剂量设置 ❖ 阴性对照组/溶剂对照组； ❖ 受试物至少三个剂量组； ❖ 阳性对照组；
染色体畸变试验
方法
❖ 细胞复苏、培养； ❖ 受试物处理； ❖ 加入秋水仙素，使细胞停止于分裂中期； ❖ 收获细胞，滴片 ❖ 空气干燥，染色
染色体畸变试验
处理条件 ❖ 包括代谢活化和非代谢活化条件 ❖ 在处理后6和24小时收获细胞 ❖ 代谢活化条件下，受试物处理时间为3小时
染色体畸变试验
读片分析 ❖ 有丝分裂指数－毒性 ❖ 染色体结构畸变 ❖ 染色体数目畸变
遗传毒性传统试验方法
3 小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）
❖ 试验系统 小鼠淋巴瘤L5178Y TK+/-细胞
ICH S2A+S2B=S2(R1)
遗传毒性标准组合试验的修订
S2B
S2R1
选择一
选择二
细菌回复突变试验 （with repeat）
体外哺乳动物细胞试验： CA / MLA
10mM Cell growth:50%
/ RTG: 80%
体内微核试验 （单独一项且是急性毒性试
验）
细菌回复突变试验 （No repeat）
主要内容
1
药物遗传毒性评价的指导原则
2
遗传毒性试验方法的研究
3
药物致癌性评价的概要
44
传统和替代致癌试验的研究
遗传毒性传统试验方法
31 细菌回复突变试验（Ames试验）
野生型 （原养型）
突变型 （缺陷型）
人工诱变的突变株在组/色氨酸操 纵子中有一个突变，突变的菌株 必须依赖外源性组/色氨酸才能生 长，而在无组/色氨酸的选择性培 养基上不能存活，致突变物可使 其基因发生回复突变，使它在缺 乏组/色氨酸的培养基上也能生长。
❖ 既能够检测点突变，也能够检测出大的染色体损伤 ❖ 自发突变率高，需要定期清除自发突变。
小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）
基本原理
Thymidine Kinase (TK): 233 amino acids Coded by the autosomal tk gene
tk gene: Situated at the distal end of the q-arm of chromosome 11 (mouse) or chromosome 17 (human)
July 2007
FDA-CDER
FDA-CDER
EMEA
EMEA
EMEA
遗传毒性标准组合试验的修订
Step 1
Step 2
Step 3
Step 4
2006
• 2006.06 ICH SC 同意启 动修订工作 • 2006. 10 ICH EWG 讨论 筹划修订方法
2007
2008
2009~20 11
TA 98 TA 100
D3052 urvB- rfa- bio-
G46
urvB- rfa-
bio-
TA 102
G428 urvB+ rfa- bio-
WP2uvrA
tryp E uvrA-
-
-
质粒
----pKM101 pKM101 pKM101 pKM101 pKM101
可检测的 突变类型
碱基置换 移码 移码
TK基因突变试验中，要使用短时处理(3～4小时) 方式。但张立实和Honma等的研究表明，使用长 时间(24或48小时)处理可显著提高MLA对某些染色 体断裂剂和纺锤体毒物的检出率。
小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）
突变选择剂
在MLA中最初使用5-溴脱氧尿苷（BUdR）作为突变选择剂，后来改用 三氟胸苷（TFT）。二者均为胸苷类似物，都能被胸苷激酶磷酸化，其 磷酸化产物掺入DNA 可导致 tk+/- 细胞死亡。但TFT的作用比BUdR更 迅速， TFT在一个细胞世代即可阻滞 tk+/- 细胞，因此TFT选择平板背 景清晰；而BUdR则需要经历数个细胞世代才能完全阻滞 tk+/- 细胞， 故可产生分散的微小集落（microcolony），形成特征性的背景阴影（ background haze）。因此，现TFT已基本取代了BUdR，成为TK基因 突变试验的常规选择剂。
Ames试验
结果观察和判定 计数突变菌落数－致突变性 观察背景菌斑－毒性 判断是否具有致突变性
Ames试验—案例1
假设的证明
7个克隆来自0对照平皿
划线
7个克隆来自1000 ug/皿处理组 划线
全部生长: 克隆为组氨酸 回复突变克隆
无生长： 克隆不是组氨 酸 回复突变克隆
无组氨酸的VB平皿
遗传毒性试验的技术要点
遗传毒性试验的指导原则
OECD、EPA可供参考的遗传毒性指导原则
SFDA
《药物遗传毒性研究技术指导原则》ZH GPT 2-1, 2007
体外： 2项试验
• 细菌回复突变试验（Ames）—— Required • 染色体畸变试验（CA）
OR • 小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变试验（MLA）
✓ 体内：1项试验 • 微核试验（MN）—— Required
The growing colony — TFT resistant ( TK -/- ) mutant
小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）
培养基 不含马血清的RPMI1640培养基 含10%马血清的RPMI1640培养基 含20%马血清的RPMI1640培养基
小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）
受试物处理时间
Size of tk gene: 11 kb with 5 introns
tk locus mutation: tk+
tk- allele
caused by T
G transversion at position 489
MLA 基本原理
Target cell：Mouse lymphoma L5178Y tk +/- 3.7.2C cell line ( D.Clive & P.Voytek. Mutat Res, 1977 )
和0.05mML－组胺酸 ） 混合后，铺于底层琼脂上，室温凝固。
Ames试验
预培养法
- 将下列物质在冰浴上混合： 0.5 mL S9混合液或0.5 mL磷酸缓冲液 0.1mL过夜培养菌液（大约10^8菌量） 0.01 mL受试物溶液（或对照，溶剂和阳性对照物溶液）
- 将该混合液在37℃下培养20分钟（水浴中） - 然后加入2mL含有0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5 mM生物素和0.05mM L－
ICH S2(R1)修订小结
S2A和S2B整合入一个指导原则中； 提供可选择的遗传毒性试验组合； 减少体外哺乳动物细胞试验不相关的 阳性； 体内遗传毒性试验可以整合入重复给 药毒性试验中； 无需每一项体内试验都设同步的阳性 对照； 体外细菌突变试验无需重复试验。
ICH S2(R1)
Pfuhler S. et al. 2009
药物遗传毒性和致癌 性研究现状和动向
常艳 国家上海新药安全评价研究中心
2020/4/23
1
主要内容
1
药物遗传毒性评价的指导原则
2
遗传毒性试验方法的研究
3
药物致癌性评价的概要
44
传统和替代致癌试验的研究
遗传毒性评价的指导原则
药物研发监管的主要药政实体
SFDA - 中国国家食品药品监督管理局 ICH - 人用药物注册技术规定国际协调组织 OECD - 经济合作发展组织 EMEA - 欧洲药品评价局 US FDA - 美国药监局 US EPA - 美国环境保护署 MHLW - 日本厚生劳动省 其他世界性的政府法规部门
小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）
移码 碱基置换
碱基置换 碱基置换
Ames试验
Ames试验
浓度设置 ❖ 阴性对照组/溶剂对照组； ❖ 受试物至少五个剂量组； ❖ 阳性对照组；
Ames试验
方法
平板掺入法：
- 0.1 mL受试菌液； - 0.1 mL受试物、溶剂对照或阳性物溶液； - 0.5 mL磷酸钠缓冲液/S9混合液； - 2.0 mL融溶的顶层琼脂 （0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5 mM生物素
组胺酸的融溶顶层培养基，铺至基础培养琼脂表面（V-B培养基E），在 室温下凝固。
Ames试验
代谢活化系统
❖ 大鼠肝S9混合液 ❖ S9制备方法：取5只雄性大鼠，处死大鼠的前5天单次
腹腔注射给予500 mg/kg的Aroclor 1254。处死，放血 ，无菌取肝组织，匀浆，经9000g离心10分钟后的上清 液部分为S9。将S9分装成2-4mL/管，冷冻保存在-70℃ ～-85℃。