第十二章发酵工程下游工程技术第一节发酵液的预处理与固-液分离1.1 概述发酵产物的提取与精制属于发酵工程的下游加工技术。

下游加工亦称发酵后处理，是指从发酵液或酶反应中分离纯化目的产物并加工成成品的过程。

在多数情况下是从稀的发酵液中回收目的产物，整个过程有多项单元操作组成，其中有许多是经典的化工单元操作。

上游加工下游加工一、下游加工过程的重要性1.获得商业产品的关键环节。

2.促进发酵工程上游加工技术或工艺的改进。

3.拥有市场竞争力的重要保证。

二、下游加工过程的特点1. 发酵液是复杂的多相系统，属非牛顿液体，从中分离所需产品困难大。

2. 发酵产品在培养液中具有浓度低，稳定性差，对酸碱等外界环境十分敏感，容易失活。

3. 下游加工过程代价昂贵，产品回收率不是很高。

4. 发酵过程复杂，要求下游加工工艺应具有相当的适应性，以确保最终产品的纯度和质量。

三、下游加工的原则和要求原则：1）短时间内处理2）分离时尽量低温3）选择生物物质稳定的pH4）要程序化进行清洗，消毒，包括厂房，设备，管路要求：1）达到所需的纯度2）成本要低，得率高3）工艺过程要简便，对分离物质特性清楚4）废弃物要易处理，能够做到综合利用（零排放；清洁生产）5）实验室产品能够放大生产四、下游加工工程的一般流程1. 粗分离阶段（1）发酵液的预处理和固-液分离。

（2）产物的初分离。

2.纯化精制阶段（3）产物的高度纯化。

（4）成品加工。

1.2 发酵液的预处理与固-液分离一、发酵液的一般特征1. 含水量高，一般可达90％～99%，处理体积大。

2. 产品浓度低。

3. 悬浮物颗粒小，密度与液体相差不大。

4. 固体粒子可压缩性大，一压缩就变形。

5. 液体黏度大，大多为非牛顿型流体。

易吸附在滤布上。

6. 产物性质不稳定，不耐热、酸碱敏感、易被氧化、易被微生物污染及酶分解。

二、发酵液预处理的目的和要求1.预处理的目的（1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率；（2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液体）；（3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。

2.发酵液预处理的要求:（1）菌体的分离（2）固体悬浮物的去除（3）蛋白质的去除（4）重金属离子的去除（5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除（6）改变发酵液的性质（7）调节适宜pH值和温度三、发酵液预处理的方法1. 降低液体的黏度2. 絮凝法3. 重力法4. 等电点法5. 加入助滤剂6. 加入反应剂1 降低液体黏度（1）加水稀释法采用加水稀释法虽然能降低液体黏度，但是会增加发酵液的体积，因此加大后续过程的处理量。

稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才算真正有效，即若加水一倍，则稀释后液体的黏度必须下降50%以上，才能有效提高过滤效率。

（2）加热法升高温度可以降低悬浮液的黏度，除去某些杂蛋白，降低悬浮物的最终体积，破坏凝胶状结构、增加滤饼的空隙度，提高过滤效率。

不适用热敏性的物质，而且要防止加热导致细胞溶解，胞内物质外溢。

（3）添加酶制剂比如：加酶将多糖转化为单糖2. 凝聚和絮凝法凝聚和絮凝的概念:凝聚是在高价无机盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。

絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。

凝聚原理：电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使范德华力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子。

(扩散双电层的结构模型图）常用的凝聚方法：在稀溶液中加入电解质以促进凝聚。

试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。

常用的凝聚剂Al2(SO4)3.18H2O，AlCl3.6H2O，FeCl3，ZnSO4，MgCl2阳离子对负电荷的胶粒凝聚能力次序为：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+絮凝原理：在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。

絮凝剂通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。

当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架连接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。

絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如---COOH）或阳离子（如---NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。

常用的絮凝剂：明胶、甲基纤维素、多聚丙烯酸、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠影响絮凝的因素：絮凝剂的添加量；发酵液的pH；絮凝剂的分子量；搅拌转速；搅拌时间3. 重力法在工业上用的较多的主要是离心和过滤。

过滤常用板框真空吸滤或电动筛等，离心和过滤能否顺利进行取决于很多因素。

一般温度高，压力大，发酵液粘度小，滤布选用适当，助溶剂适宜，搅拌都可以提高过滤速度。

4、等电点法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。

胶体粒子的稳定性和其所带电荷有关。

蛋白质在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。

因此可利用此特性分离或去除良性物质。

羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.0－5.5）。

5、添加助滤剂：一般为惰性助滤剂：是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质作用：助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可以保持良好的渗透性使用方法（1）：在滤布上预涂，作为过滤介质使用（2）：按一定比例混入待滤的悬浮液中常用的助滤剂：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的碳、炉渣、重质碳酸钙6、添加反应剂：添加可溶解的盐类，生成不溶解的沉淀。

1.3 固-液分离过程及设备简介目的：收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。

意义：固-液分离过程下游加工的重要环节，用于发酵液的预处理和生物产品的纯化、精制等环节。

方法：常用的方法有过滤、离心。

此外还有膜分离、双水相萃取和扩张床吸附等方法。

影响发酵液固-液分离的主要因素：菌体的大小、形状及发酵液的黏度，还有发酵液的温度、pH值、加热时间等。

1. 过滤定义：用过滤介质将悬液中的固形颗粒与液体分离的过程。

常用的过滤方式：加压过滤和真空过滤典型设备主要有：板框压滤机和鼓式真空过滤机2、离心定义：基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。

离心分离方法：(1)差速离心—工业上最常用的离心分离方法定义：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。

对象：混合样品中各沉降系数差别较大的组分。

(2)密度梯度离心—多用于生化研究原理：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。

分类：1）移动区带离心2）等密度离心常用密度梯度物质：蔗糖、甘油、CsCl、NaBr1）移动区带离心含几个组分的样品在足够高的离心场中离心时，每种颗粒都达到其最大沉降速度，这时样品开始分离。

离心管的上层逐渐形成透明的上清液，并形成对应于样品各组分的一系列浓度界面，界面的移动相对于每种组分来说是特征的。

用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。

此法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。

2）等密度离心细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在该层达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。

离心机分类：离心分离（1）优点：①分离速度快，效率高，②操作时卫生条件好等优点，③适合于大规模的分离过程。

（2）缺点：①投资费用高，②能耗较大。

3.其他固-液分离方法（1）膜分离：利用不同组分通过膜的传递速度不同而得以分离的方法。

（2）双水相萃取：利用不同组分在双水相分配系数不同进行分离方法。

（3）扩张床吸附：将固-液分离合目的产物吸附合并成一步进行的一种分离方法。

影响固液分离的因素：1、微生物种类真菌的菌体大，固液分离容易，可采用真空转鼓式过滤或板框过滤；细菌和细胞碎片小，固液分离较难，固液分离前要进行预处理。

2、发酵液黏度固液分离速度与黏度成反比。

3、其它因素培养基组成、发酵周期、发酵液的pH值、温度和加热时间等第二节下游提纯过程2.1 微生物细胞的破碎微生物的代谢产物如果是胞内物质（如有些酶制剂、干扰素、胰岛素等），那么首先要收集菌体，进行细胞破碎。

1. 微生物细胞壁的组成与结构：（1）细菌细胞壁：（2）酵母菌细胞壁比G+菌稍厚，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等。

（3）其他真菌细胞壁主要由多糖组成，如几丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。

2. 常用的细胞破碎方法细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的方式可分为机械法和非机械法两大类。

亦可按所用方法的属性分为物理法、化学法和生物法三类。

物理破碎法：高压匀浆法、挤压法、高速珠磨法、超声波法；化学破碎法：渗透冲击法、增溶法。

生物破碎法：酶溶法。

（1）物理破碎法①高压匀浆法大规模细胞破碎的常用方法原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。

适用范围：适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。

不适用于高度分枝的微生物。

特点：在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。

②挤压法（X-press法）将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃至-30℃形成冰晶体，利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出使之破碎。

原理：细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。

主要用于实验室中。

优点：适用的范围广、破碎率高、细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。

缺点：对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。

③高速珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。

缺点：破碎中产生的热量，需采用冷却措施。

优点：可连续操作④超声波破碎法超声波破碎也是应用较多的一种破碎方法。

通常采用的超声波破碎机在15-25千赫（kHz）的频率下操作。

原理：在超声波作用下液体发生空化作用，空化泡的急剧膨胀压缩和内向爆破产生冲击弹性波，将声能转化为机械能，形成粘性消散涡流，如果液体旋涡小于细胞尺寸，产生不同密度移动，当细胞的动能超过细胞壁强度时，至使细胞破碎。