基因工程实验实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化试剂A.LB液体培养基（L）: 1000ml蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeast extract）5g,NaCl 10g,加去离子水至1000ml用5MNaOH调至pH7.2-7.5。

121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。

B.LB固体培养基（L）：每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。

C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。

Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。

D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/LEDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。

E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS.F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml.G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/LNaCl, 终浓度为10mg/ml。

100 o C加热15分钟，冷却后分装。

H.饱和酚：市售酚需重蒸。

重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。

I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。

J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。

K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。

三、操作步骤1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。

用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含 50μg/ml Amp）中，37 o C培养约12小时至对数生长后期。

2．质粒DNA的少量快速提取---碱裂解法A.取1.5ml培养液倒入1.5ml ependorf 管中，4o C下12000g离心3min。

B.弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。

C.菌体沉淀重悬浮于100μl预冷的溶液I中（激烈震荡，充分混匀）。

D.加入新配制的溶液II 200μl，快速盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒ependorf管6-8次，以混匀内容物（千万不要震荡）,放置5分钟。

E.加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒ependorf管数次，以混匀内容物，放置5分钟。

4o C下12000g离心5-10分钟。

F.将上清液移入干净ependorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1：1）(吸取酚/氯仿试剂瓶中的下层溶液)，震荡混匀，4o C下12000g离心5分钟。

G.将上清液（水相）移入干净ependorf管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(吸取氯仿/异戊醇剂试瓶中的下层溶液)，震荡混匀，4o C下12000g离心5分钟。

H.将上清液（水相）移入干净ependorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，震荡混匀后置于-20o C冰箱中20分钟。

然后在 4o C下12000g离心10分钟。

I.弃上清液，将管口敞开并倒置于卫生纸上，使液体流尽。

加入0.3ml 70%乙醇洗涤沉淀。

4o C下12000g离心5-10分钟。

J.吸去上清液，将管倒置于卫生纸上，使液体流尽，室温干燥或真空干燥10分钟K.将沉淀溶于20μl TE缓冲液（pH8.0, 含20μg/ml Rnase A）中，储于-20o C冰箱。

实验二、基因组DNA的提取1.1 材料1.1.1植物材料银杏等木本植物。

1.1.2 主要试剂CTAB抽提液：1g CTAB，5ml 1M Tris，2ml 500mM EDTA，4.1g Nacl至50ml。

(2% CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0)CTAB/NaCl：10g CTAB，4.1g NaCl，溶解后定容至100ml。

(10% CTAB，0.7M NaCl) TE/NaCl：0.5ml 1M Tris，10μl 500mM EDTA，2.9g NaCl，至50ml。

(10mM Tris，0.1mM EDTA，1M NaCl，pH8.0)。

RNase: 溶于10mM Tris.Cl(pH7.5)，15mM NaCl溶液中，配成10mg/ml浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，添加等体积甘油后贮于-20度。

3 mol/L NaAc(pH 5.2)，氯仿:异戊醇（24:1）。

β-巯基乙醇，氯仿，异丙醇，异戊醇，饱和酚，无水乙醇，不溶性PVP等。

上述药品及Lambda DNA/Hin dIII均购自上海生物工程公司。

1.2改进的CTAB法根据文献（Frederick M. et al.，1998）CTAB法，稍做改进。

具体步骤：① 吸取8ml CTAB抽提液，加入320μl β-巯基乙醇，混匀，预热至65℃；② 称取0.5克叶片，置于事先用液氮预冷的研钵中，快速加入适量不溶性PVP，加入液氮研磨成粉未；③ 迅速将粉未倒入至CTAB抽提液中，摇匀，65℃保温1h，期间每隔5min 摇匀一次；④ 加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次，10000rpm离心5min；⑤ 将上清液转入另一无菌离心管中，加入1/10体积CTAB/NaCl、等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀，10000rpm离心10min；⑥ 将上清液转入一无菌离心管中，加入2/3体积异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃冰箱中一小时，然后10000rpm 离心10min；⑦ 弃掉上清液，加入TE/NaCl缓冲液溶解沉淀，10000rpm离心；⑧ 上清液转入一个1.5ml无菌离心管中，加入1/10体积NaAc及2/3体积异丙醇，颠倒混匀，此时会出现絮状沉淀，钩出此沉淀，在70%乙醇中漂洗数次，用无菌滤纸上吸干，溶于含Rnase浓度为10 μg/ml的0.5mlTE缓冲液中，37︒C 处理半小时，加入等体积的酚/氯仿（体积比为1:1），轻轻混匀，室温下静置10min，12000rpm 离心10 min，上清液转入新离心管中，加入1/10体积的3 mol/L NaAc(pH 5.2)和二倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，此时已出现DNA絮状物，－20︒C 放置30min以上，用玻璃棒钩出DNA絮团，在70％乙醇中漂洗，无菌滤纸上吸干，溶解于0.5mlTE缓冲液中，－20 ︒C保存。

电泳分析取 2μl DNA样品在0.7％琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外灯上观察和拍照。

实验三、DNA凝胶电泳与PCR2008-05-24 22:07试剂：1．5⨯TBE缓冲液：Tris. 54g, 硼酸27.5g, 加入20ml 的0.5mol/L EDTA(pH8.0), 定溶至1000ml.2．50×TAE: 24.2克Tris, 3.72克EDTANa2·2H2O, 加适量水, 搅拌并稍加热溶解后加5.71ml冰乙酸,加水至100ml.3．6⨯上样缓冲液：0.25% 溴酚兰, 40%(w/v)蔗糖水溶液。

4．溴化乙啶（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/L，用铝箔或黑纸包裹容器，储于温室即可。

5．DNA分子量标准：λDNA/EcoR I/Hind III:λDNA/EcoR I: 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9,和2.5kbλDNA/ Hind III: 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb.一、实验步骤1．电泳缓冲液可选用0.5×TBE或1×TAE，前者缓冲能力较后者强，但不适用于从胶中回收DNA，建议只采用1×TAE用于琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖用电泳缓冲液配制。

2．胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml 三角烧瓶中，进入50ml 的1×TAE稀释缓冲液，放入微波炉或电炉加热至琼脂糖全部熔化，取出混匀。

3．胶板的制备：将二端封闭的电泳槽置于水平支持物上，插上样品梳子。

在冷却至50~600C的琼脂糖胶液中加入EB溶液至终浓度为0.5μg/ml, 即10mg/ml 的母液加2.5ul，混匀。

小心地倒入电泳槽中至一定高度。

待胶液完全凝固后拔出梳子。

然后向槽内加1×TAE稀释缓冲液至液面刚好没过胶板表面。

1．胶的浓度因DNA长度而异：基因组DNA，λDNA 0.4-0.5%质粒(3-5kb) 0.7%3-1kb 0.7-1.0%1-0.5kb 1.0-1.5%4． <0.5kb 2.0%5．加样：取2-5μl样品加1μl 的6⨯上样缓冲液，用移液枪混匀（在Parafilm膜上操作），小心加到样品槽中。

同时加DNA分子量标准对照。

6．电泳：从负极到正极，60-80V, (电泳电压以5V/cm为宜, 即电泳槽的长度×5)电流40mA以上。

当溴酚兰条带移动至距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。

7．观察和拍照：在波长为254nm的紫外灯下，观察DNA电泳带并估计其分子量大小。

同时可用加红色滤光片和近摄镜片的相机拍照（光圈5.6下暴光10-120秒）。

实验四、聚合酶链式反应(PCR)扩增PCR反应：1体系：取0.5ml 的eppendorf 管中依次加入效率试剂（共40.5μl）:35μl H25μl 10XPCR反应缓冲液4μl 25mmol/L MgCl24μl 4种 dNTP0.5μl 上游引物（引物1）0.5μl 下游引物（引物2）0.5μl 模板DNA(约1ng)0.5ul TaqDNA聚合酶（约2.5单位）混匀后离心5秒钟2程序：混合物在94℃下加热5min94 ℃变性30秒种，62℃退火一分钟，72℃延伸2分钟，循环35轮，进行PCR。

最后一轮循环结束后，于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。

电泳：取10ul扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。

实验五、DNA片段的回收DNA凝胶回收试剂盒TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0操作方法操作流程见图1，全套操作约需30分钟，详细说明如下。

1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。

此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。