b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部_双__链_____。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物开始进行碱基互补配对，合成与 模板互补的_D_N__A_链___。
（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因
前提：基因比较小、核苷酸序列已知
蛋白质 推测 mRNA 推测 基因DNA 合成 目的
的氨基
核苷酸
的核苷酸
基因
酸顺序
序列
序列
DNA合成仪
问题4 获取目的基因的三种方法应用
1、如果知道目的基因两端的核苷酸序列，而 且基因比较大，可采用_P_C_R__技__术_扩__增__ 2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较 小，可采用_化__学_方__法__人__工__合_成___ 3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采 用从__基__因__文__库_获__取__的__方__法
标记基因：鉴别受体细胞中 是否含有目的基因，从而将 有目的基因的细胞筛选出来
3.基因表达载体的构建过程
质粒
DNA分子
同一种 限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
两个切口 四个黏性末端
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
跟踪训练 (2012年江苏无锡高二检测)如图为基
因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体
第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用 下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
问题2 为什么用生物发育某个时期的mRNA反转 录得的DNA只有这种生物的部分基因？
某个时期的发育是基因选择少 物种间的基因交流
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断， 导入到受体菌的群体中储存，各个受体们所需的目的基因呢?
为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞？ 全能性受限制
（1）农杆菌转化法 ①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植
物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受 体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③过三程、： 目的基因导入受体细胞
转入
构建基因表达载体
农杆菌 导入
植物细胞
稳定维持和表达
（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞
以目的基因转录成 的信使RNA为模板，反转 录成互补的单链DNA，然 后在酶的作用下合成双 链DNA步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA 互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链 降解，使之变成单链的DNA。
根据基因的核苷酸序列、基因的 功能、基因在染色体上的位置、基因 的转录产物mRNA、基因的表达产物 蛋白质等定发育时期的mRNA
反（逆）转录酶
单链DNA
DNA 聚合酶
双链cDNA片段
与载体 连接
重组载体
导入受体菌 中储存
反转录法：
2 常用的受体细胞： 大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌 和动植物细胞等。
3 目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
4、目的基因导入受体细胞的方法
生物种类 植物细胞
农杆菌转化法 常用方法 基因枪法
花粉通道法
动物细 胞
显微注 射法
微生物细胞 Ca2＋处理法
受体细胞 一般是体细胞 受精卵 一般原核细胞
物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮 藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰 素基因等。
2、也可以是具有调控作用的因子
获取目的R技术扩增目的基因 已知序列
3、人工合成பைடு நூலகம்的基因(一)从基因中获取目的基因1.基因概念
的说法错误的是( B ) A．基因工程的核心步骤是基因表达
载体构建 B．任何基因表达载体的构建都是一
样的，没有差别 C．图中启动子位于基因的首端，是
RNA聚合酶识别和结合的部位 D．抗生素抗性基因的作用是作为标
记基因，用于鉴别受体细胞中是 否导入了目的基因
三、将目的基因导入受体细胞
1 转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞 内维持稳定和表达的过程。cDNA 小 无 无部分基因 可以
基因组 大 有 有全部基因 部分基因可以
(二)利用PCR技术扩增目的基因
1、概念：PCR全称为__多__聚__酶__链__式__反__应__，是一项在生 物_体__外_复制_特__定__D_N__A_片__段__的核酸合成技术
2、原理：_D_N__A_复__制___
模板（目的基因） 原料(脱氧核苷酸) 3、条件： DNA聚合酶（耐高温） 引物（一小段单链DNA） 温度控制
4、操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列， 以便合成引物。
5、扩增形式：指数形式（2n）
6、结果
在短时间内大量扩增目的基因
。
7、过程： a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作
用下，氢__键___断裂，形成_单__链__D__N_A___
基因工程的基本操作顺序5
1.2 基因工程的基本操作程序
问题1
基因工程的基本操作程序主要
包括哪几个步骤？
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一：目的基因的获取 什么是目的基因
1.目的基因主要是指___编__码_蛋__白__质__的_基______ 如苏云金芽孢杆菌的因抗虫基因，还有植
二：基因表达载体的构建——基因工程的核心
1 目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并 且可以遗传给下一代，同时使目的基因 能够表达和发挥作用。
2 组成： 目的基因+启动子+终止子 +标记基因等
启动子：位于基因的首端的 一段特殊的DNA片断，RNA聚 合酶识别和结合的部位
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能终 止mRNA的转录