免疫共沉淀技术的研究进展S t u d y P r o g r e s s o f C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n T e c h n o l o g y郭纯(湖南省人民医院,湖南 长沙 410005)[摘要] 免疫共沉淀(c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)技术是检测蛋白质间相互作用的经典方法,也是较常用的方法。
文章对近10余年有关免疫共沉淀技术的原理和应用及其优缺点的分析进行文献综述。
[关键词] 免疫共沉淀;蛋白质;相互作用;技术[A b s t r a c t] C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n t e c h n o l o g y i s c l a s s i c a l m e t h o dt o e x a m i n e t h e i n t e r a c t i o na m o n g p r o t e i n s,a l s o ac o m m o n m e t h o d.T h e p a p e r m a d e a l i t e r a t u r er e v i e w,w h i c hr e f e r r e dt ot h e p r i n c i p l e o f c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o nt e c h n o l o g y a n di t sm e r i t o r f l a w.[K e y w o r d s] C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n;P r o t e i n;I n t e r a c t i o n;T e c h n o l o g y[中图分类号]R392-33 [文献标识码]A [文章编号]1672-951X(2007)12-0086-04 蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件,如细胞的增殖、分化和死亡。
通过蛋白质间相互作用,可改变细胞内蛋白质的动力学特征。
如底物结合特性、催化活性;也可产生新的结合位点,改变蛋白质对底物的特异性;还可失活其它蛋白质,调控其它基因表达。
因此,只有使蛋白质间相互作用顺利进行,细胞的正常生命活动过程才有保障。
由于蛋白质间相互作用具有如此重大的意义,因此其检测方法的研究也备受重视由生化方法,如蛋自质亲和层析(p r o t e i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y)、亲和印迹(a f f i n i t yb l o t t i n g)、免疫沉淀(i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)及交联(c r o s s-l i n k i n g),发展到当今的分子生物学方法,如以基因文库为基础的蛋白探测(p r o-t e i np r o b i n g)、噬菌体显示(p h a g e d i s p l a y)及双杂交系统(t w o -h y b r i ds y s t e m)等。
另外,还发展了可定性和定量检测蛋白质间相互作用的简便又快捷的方法,如表面胞质团共振(s u r-f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e)等。
通过这些方法的联合使用,实验得出的蛋白质间的相互作用的结论显得更为可靠[1]。
1 免疫共沉淀基本原理细胞裂解物中加入抗体,这样可与已知抗原形成特异的免疫复合物,若存在与已知抗原相互作用的蛋白质,则免疫复合物中还应包含这种蛋白质,经过洗脱,收集免疫复合物,然后分离该蛋白质,对该蛋白质进行N端氨基酸序列分析,推断出相应的核苷酸序列。
将包含活性物质的组织或细胞构建成c D N A文库,以上述核苷酸序列为探针从c D N A文库中分离出c D N A克隆。
1.1 免疫共沉淀技术的主要步骤1.1.1 用磷酸盐缓冲液洗30块10c m培养板上的适宜细胞。
刮去每块板上的细胞到1m l冰冷的E B C裂解缓冲液中。
1.1.2 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15m i n。
1.1.3 收集上清(约30m l)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1h。
1.1.4 加入0.9m l的蛋白质A-S e p h a r o s e悬液,4℃摇动免疫沉淀物30m i n。
1.1.5 用含900m m o l/L N a C l的N E T N洗蛋白A-S e p h a r o s e 混合物,再重复洗5次。
最后,用N E T N洗1次。
1.1.6 吸出混合物的液体部分。
加入800μl的1×S D S胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4m i n。
1.1.7 将样品加入到大孔的不连续S D S-P A G E梯度胶中,在10m A的恒定电流下电泳过夜。
1.1.8 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
1.1.9 从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1m l 50%乙腈洗两次,每次3m i n。
1.1.10 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。
1.1.11 通过窄孔高效液相色谱分离肽。
将收集的肽在A B I 477A或494A机器上进行自动E d m a n降解测序。
2 免疫共沉淀技术的应用2.1 肿瘤 鼻咽癌细胞中p53相结合蛋白质的分离与鉴定:免疫共沉淀与L C2E S I2M S/M S分析相结合的方法对H N E1细胞蛋白条带3鉴定的p53相互作用蛋白之一H S P78进行了验证。
首次在鼻咽癌细胞中鉴定了9个p53结合蛋白,为阐明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的机制提供了重要第13卷第12期 中 医 药 导 报 2007年12月V o l.13 N o.12 G u i d i n g J o u r n a l o f T C M D e c e m b e r.2007 DOI:10.13862/ 43-1446/r.2007.12.038依据和线索。
方法:在含2m g细胞总蛋白的1m l抽提缓冲液中,加入1μl正常兔血清和30μl p r o t e i nG-S e p h e r o s e4B 珠子,4℃、振荡2h,9000r/m i n离心5m i n去除珠子以消除非特异结合蛋白,保留上清液。
在上清液中加入5μl兔抗人p53抗体和30μl p r o t e i nG-S e p h e r o s e4B珠子,4℃,振荡过夜,9000r/m i n离心5m i n去上清液,保留珠子。
T B S T缓冲液洗涤含免疫复合物的珠子4次,每次5m i n,离心收集珠子。
以B S A取代p53抗体作为对照[2]。
人肝癌中热休克蛋白70(H S P70)与p53的相互作用:用免疫组织化学染色法,从12例肝癌组织中筛选H S P70与p53均呈阳性表达的标本,并以免疫共沉淀法提取之,然后用S D S-P A G E及We s t-e r nb l o t分析双阳性标本中两种蛋白的存在形式。
检测到12例肝癌组织中有3例为双阳性,用抗H S P70m A b免疫共沉淀的样品,可检测到p53蛋白。
用抗p53m A b免疫共沉淀的样品也可检测到H S P70蛋白,证明人肝癌中p53与H S P70以复合物的形式而存在,此可为肝癌的发病机制及免疫治疗的研究提供新的思路[3]。
肿瘤的异质性(H e t e r o g e n e i t y)是指单克隆起源的肿瘤细胞在生长过程中其侵袭能力、生长速度、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性等方面能形成不同表型亚克隆的特性[4]。
肿瘤异质性是肿瘤研究的一个重要方向,对解释肿瘤基础及临床研究中出现的诸多问题具有重要意义。
随着分子生物学技术的发展,对于肿瘤异质性的研究方法已从形态学深入到细胞生物学、分子遗传学、分子病理学等方面,但其分子水平的研究多处于基因水平,而对蛋白质方面的研究甚少。
由于蛋白质是生命活动的执行者和体现者,细胞各种重要的生理过程都是以蛋白质间相互作用来实现的,因此通过研究蛋白质的相互作用来探讨肿瘤异质性,将更直接、全面揭示异质性的发生机理及调控过程。
免疫共沉淀用于细胞异质性分析在操作上亦需注意以下几点:(1)细胞全蛋白的质量浓度要足够,至少要高于10m g/m l,这样沉淀物洗脱液中的蛋白质才能达到足够的质量浓度以用于电泳。
(2)S D S-P A G E一定要尽量用大块的胶,因为只有经过足够长距离的电泳才能使样品各成分充分分开,以便于进一步分析、提取和测序。
免疫共沉淀法用于细胞异质性的分析,操作简单,结果直接明了,自动化分析快速且排除人为影响因素,分离后胶上蛋白质能有效回收,有利于后续的测序等分析工作。
因此借助于免疫共沉淀法来研究肿瘤异质性的分子机制无疑是一条很好的途径,随着这一研究方法的完善,它将在细胞异质性的研究中发挥重要作用[5]。
2.2 酶与病毒 端粒酶(或端粒体酶)是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶,主要成分是R N A和蛋白质,其含有引物特异识别位点,能以自身R N A为模板,合成端粒D N A并加到染色体末端,使端粒延长,从延长细胞的寿命甚至使其永生化[6]。
根据目前的研究,端粒酶至少有3个亚单位组成,R N A亚单位T R(t e l o m e r a s e R N A)、端粒酶催化亚单位T E R T (t e l o m e r a s e r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e)和T E P1(t e l o m e r a s e-a s s o c i-a t e dp r o t e i n1)。
人类T E R T(h T E R T)是由1132个氨基酸残基组成的多肽,h T E P1可与p123/E s t2p的同源蛋白h T E R T免疫共沉淀,并和端粒酶活性有关[7～9]。
应用免疫共沉淀技术,验证新基因A n g R e m l04和糖皮质激素受体特异延伸因子(G R-E F)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究A n g R e m l04的生理功能奠定基础。
A n g R e m l04是我们在血管紧张素I I(A n g I I)刺激人肾小球系膜细胞(M S C)增生和硬化过程中获得的上调表达新基因,全长1690b p,蛋白相对分子质量为37000,是一个多组织广泛表达的基因,在肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞均有A n g R e m104m R N A表达[10]。