生命的基本特征：①细胞是生物的基本组成单位（病毒除外）②新陈代谢、生长和运动是生命的基本功能③生命通过繁殖而延续，DNA是生物遗传的基本物质④生物对外界可产生应激反应和自我调节，对环境具有适应性生物学经历的三个阶段：描述生物学阶段、实验~、创造~生物技术：也称生物工程，是以现代化生命科学为基础，运用先进科学原理和工程技术手段按预先的设计来加工或改造生物材料，从而产生出人类需要的产品或达到某种目的生物技术发展三个阶段：作坊式生物技术、工业化~、现代~生物技术内容：基因工程技术、细胞~、酶~、发酵~、蛋白质~细胞工程：指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术蛋白质工程：是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。

蛋白质工程也成为“第二代基因工程”生物技术基本特征：①高效益②高智力③高投入④高竞争⑤高风险⑥高势能透光度t：某一波长的光透过某一物质的溶液时，其入射的角度I0与透过溶液后的强度I相比发生了变化：I与I0的比值（I /I 0)称为透光度实验室常用水的制备：①利息交换法②蒸馏法③反浸法④超纯法消毒灭菌方法：①高压高温灭菌②干热灭菌③滤膜灭菌④化学消毒法⑤紫外线灭菌⑥抗生素灭菌消毒核酸的一级结构：线性结构，核苷酸的排列顺序，也称碱基序列二级结构：双螺旋结构三级结构：超螺旋结构DNA的变形：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程增色效应：核酸变性后，在260nm处吸收值上升DNA的复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象减色效应：DNA复性时，OD260值下降影响复性速度的因素：①溶液温度的高低②单链片段的大小③单链片段浓度④溶液离子强度的大小⑤片段内重复序列的多少OD260的应用：OD260=1.0 相当于①50ug/ml 双链DNA ②40ug/ml 单链DNA或RNA③20 ug/ml 寡核苷酸基因（分子生物学概念）：基因是DNA双螺旋分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列管家基因：某些基因是维持细胞基本代谢所必须的基因，其在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达阅读框架：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码子为止的一个连续编码序列基因的结构：外显子、内含子、前导区、尾部区、调控区三个关键因素：①自由复制的DNA序列②着丝粒DNA序列③端粒DNA序列原核生物和真核生物染色体的区别：①原核生物的染色体实质上是一个裸露的DNA双螺旋结构，DNA通常呈环状，且与相对少量的蛋白质结合，长度可打达几厘米，DNA复制从单一复制起点开始②真核生物都有许多线状的染色体，且染色体存在于细胞核内，真核生物染色体由DNA、组蛋白、RNA、非组蛋白等成分组成。

这些蛋白具有功能或结构方面的作用。

染色体DNA的数量远比原核生物多。

每条染色体有多个复制起点分离纯化核酸的总原则：①保证核酸的一级结构完整性②防止核酸的生物降解③排除其他分子的污染真核细胞DNA制备实验基本原理：要从组织中提取DNA就必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎包膜及核膜，使染色体释放出来，同时还要除去与DNA结合的组蛋白及非组蛋白质粒按复制方式分：松弛型质粒、严密性质粒质粒特性：①分子相对小②含高效的自主复制成分③不相容性④转移性⑤选择的标记⑥限制性内切酶单一切口碱裂解法原理：在PH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭合环质粒DNA人为自然状态。

将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA 之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS作用下形成沉淀，儿质粒DNA 仍为可溶状态。

通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。

质粒尚在上清中，在用酚氯法抽提进一步纯化质粒DNA电泳：是指带电粒子在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。

影响电泳迁移率的因素：1，样品：即颗粒所带净电荷的数量、大小及形状。

2，支持介质：惰性材料有一定坚韧度，吸附力小，无电渗作用。

吸附作用：是介质对样品颗粒的吸附作用，所以出现拖尾和条带不均匀，纸最大，醋酸纤维素介质最小，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶居中。

电渗：在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动为电渗。

其产生原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基因，因此吸附溶液中的正离子和负离子，使溶液分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现不同的迁移率，这就是分子筛效应。

影响凝胶电泳的因素：1DNA分子的大小2琼脂糖的浓度3DNA分子的构象 4 电源电压5嵌入燃料的存在6离子强度的影响聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点：1、在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。

2、化学性能稳定，与初分离物不起化学反应在很多溶剂中不溶。

3、对PH和温度变化较稳定。

4、几乎无吸附和电渗作用。

5、样品不易扩散，用量少。

其灵敏度可达10-66、凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。

7、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中集浓缩，分筛和电荷效应为一体。

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理：当向蛋白质溶液中加入足量SDS，可引起构象改变，蛋白质—SDS形成的复合物近似“雪茄烟“形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于分子量大小，所以它们以相等的迁移率速度从浓缩胶进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而别分离。

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤：1、胶膜固定2、制备分离胶3、制备浓缩胶4、准备电泳5、上样6、电泳7、染色8、脱色9、观察结果第六章限制性核酸内切酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。

细菌限制性内切酶的修饰机理：各种细菌都可以合成一种或几种切割顺序专一的DNA内切酶，，这种酶的主要功能是对外源性的双链DNA进行切割、水解不允许外源性DNA存在细菌自身细胞内，而自身的DNA可以不受酶的切割因为细菌细胞还合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核苷酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解，这就是限制性内切酶修饰系统。

限制性内切酶分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型Ⅱ型特点：①限制性内切酶修饰系统是由两种酶分子组成的，一种为限制性内切酶另一种为独立的早基化酶，其修饰作用是与限制性内切酶识别位点相重叠的序列。

②识别特定的核苷酸序列3、具有特定的酶切位点酶活性单位：在一定温度，PH及离子强度条件下，1小时内完全酶解（切割）特定底物DNA，所需要限制性内切酶的量，为该酶的活性单位。

酶的标准反应体系：在50ML反应体系中及指定温度下，使用特定的缓冲体系，用一个活性单位的限制性内切酶酶解1pg底物DNA反应1小时，为该酶的标准反应体系。

星号活性：限制性内切酶在非标准反应条件下，某些限制酶的识别或切割位点发生改变，不再严格遵循识别位点酶解DNA的活性称星号活性。

基因克隆：通过体外重组技术将一段目的DNA经切割，连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程基因重组可分为三个水平：整体水平，细胞水平和分子水平一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：①获得待克隆的DNA片段（基因）②目的基因与载体在体外连接③重组DNA分子导入宿主细胞④筛选、鉴定阳性重组子⑤重组子的扩增与表达载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫做载体作为基因克隆的载体必须具备以下特征：①载体必须是复制子②具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选③具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入④自身分子量较小，拷贝数高⑤在宿主细胞内稳定性高载体的种类按其功能分类：克隆载体、表达载体、整合载体载体根据外源性DNA进入载体的方式特点分为：插入型载体、替代型载体常用的载体可以分为三大类：质粒、噬菌体及病毒质粒生物学的特性：①质粒是染色体外能够进行自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子，它并不是细菌生长所必须的，但可以赋予某些细菌抵御外界环境因素不利影响的能力②质粒的大小差异很大，最小的只有1kb，只等编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb ③质粒生存在寄主细胞中“友好”的“借居”，离开了寄主它本身无法复制，同时质粒往往有宿主专一性④质粒的复制类型，一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为严紧型质粒（大）。

细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞中只有1-2个质粒⑤质粒的不亲和性，两种亲缘关系密切的不同不能在同一宿主细胞内质粒不相容性：同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定的保持在一个细胞内的现象质粒相容性：若两种质粒进入同一细胞时能够一起复制并共存于该宿主细胞内称为质粒相容性⑥质粒的转移性转移性质粒：含有接合转移基因，能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞非转移性质粒：不含有接合转移基因，⑦质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种λ噬菌体感染机理：在感染早期以以环状分子进行转录之后有两种生活途径，一种是溶菌周期：烈性噬菌体又叫溶菌循环，即环状DNA的多次复制，合成大量基因产物，组成噬菌体颗粒，宿主菌裂解后，流向下一个循环感染烈性噬菌体溶菌生长的基本过程①吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上②注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞③转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所④合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质⑤组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒⑥释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来DNA重组：DNA分子的体外重组是指在体外的条件下采用一定的技术将任何感兴趣的DNA 片段连接在一起的过程适当的宿主细胞必须符合以下条件：①对载体的复制和扩增没有严格的限制②不存在特异的内切酶体系降解外源DNA ③在重组DNA增殖过程中不会被修饰④重组缺陷型DNA 不会产生体内重组⑤容易导入重组DNA分子⑥符合重组DNA操作的安全标准重组克隆的筛选方法：①抗药性标志的筛选②蓝白斑筛选法③菌落快速裂解鉴定法④内切酶图谱鉴定法⑤通过聚合酶链式反应筛选重组子⑥噬菌斑形成能力筛选法平台期效应：反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而是进入线性增长期或静止期，即出现“停止效应”。

反应体系：4中dntp混合物，引物，模板DNA，TagDNA聚合酶，Mg2+。

引物设计原则：1.序列要位于高度保守区。