一、：1.气相：是一种物理的分离方法。

利用被测物质各组分在不同两相间（）的微小差异，当两相作时，这些物质在两相间进行反复多次的分配，使原来只有微小的性质差异产生很大的效果，而使不同组分得到分离。

2.液相：是在经典的基础上，引用了的理论，在技术上，改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）;是以特殊的方法用小粒径的填充而成，从而使柱效大大高于经典（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的，可对进行连续检测。

二、应用范围：1.气相：具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或差的物质都难于应用进行分析。

一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采用衍生化法或法。

2.液相：，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。

对于高沸点、差、相对大（大于400 以上）的（些物质几乎占总数的75% ～80% ）原则上都可应用来进行分离、分析。

据统计，在已知化合物中，能用的约占20%，而能用分析的约占70～80%。

三、仪器构造：1.气相：由载气源、进样部分、、柱温箱、和组成。

进样部分、和的温度均在控制状态。

1.1 柱箱：色谱柱是的心脏，样品中的各个组份在色谱柱中经过反复多次分配后得到分离，从而达到分析的目的，柱箱的作用就是安装色谱柱。

由于色谱柱的两端分别连接和检测器，因此和检测器的下端（接头）均插入柱箱。

柱箱能够安装各种和柱，并且操作方便。

色谱柱（样品）需要在一定的温度条件下工作，因此采用微机对柱箱进行温度控制。

并且由于设计合理，柱箱内的很小。

对于一些成份复杂、沸程较宽的样品，柱箱还可进行三阶控制。

且程序设定后自动运行无需人工干预，降温时还能自动后开门排热。

1.2 ：进样器的作用是将样品送入色谱柱。

如果是液体样品，进样器还必须将其，因此采用微机对进样器进行温度控制。

根据不同种类的色谱柱及不同的进样方式，共有五种进样器可供选择：1.进样器2.器附件3.分流进样器附件4.毛细管分流/器5.六通阀气体进样器1.3检测器:检测器的作用是将样品的化学信号转化为（）。

检测器也需要在一定的温度条件下才能正常工作，因此采用微机对检测器进行温度控制。

根据各种样品的特性，共有五种检测器可供选择：1.(FID)2.(TCD)3.(ECD)4.(NPD)5.(FPD)1.4该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

2.液相：主要有、输液系统、分离系统、检测系统和组成。

2.1一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。

这对提高分析样品的是有益的。

2.2 输液系统该系统包括、贮存器和仪三部分。

的一般压强为l．47～4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压通过时，可降低样品在柱中的，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。

流动相贮存错和仪，可使流动相随和样品的性质而改变，包括改变的极性、、PH值，或改用或等。

这就可使各种物质（即使仅有一个的差别或是）都能获得有效分离。

3.3 分离系统该系统包括色谱柱、连接管和等。

色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），为2～5mm，由"优质或厚壁玻璃管或等材料制成，住内装有直径为5～10μm的（由和构成）．中的是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有（如硅胶表面的基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与中固定相的制备一样），或者用化学法各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、、氨基或各种长度碳链的等）或的。

因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。

例如，在多孔性硅胶表面豌豆（PSA）后，就可以把中的一种分离出来。

另外，固定相粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低效应。

基度小，浅，样品在区内短。

这些对缩小、提高分辨率是有益的。

根据柱效理论分析，基度小，数N就越大。

这也进一步证明基度小，会提高分辨率的道理。

再者，的可使温度从室温调到60C，通过改善速度，缩短分析时间，就可增加的效率。

2.4 检测系统常用的检测器有、和三种。

（1）该检测器适用于对（或）有吸收性能样品的检测。

其特点：使用面广（如蛋白质、、、、、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液的样品。

（2）凡具有与流动相不同的样品组分，均可使用检测。

，糖类化合物的检测使用此检测系统。

这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／ml），流动相的变化会引起的变化，因此，它既不适用于，也不适用于样品的检测。

（3）凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧与物质的浓度成正比。

因此，这一检测器只适用于具有荧光的（如、、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml），和作品的检测均可采用。

2.5 系统该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

光度定义分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。

常用的波长范围为：(1)200～400nm的紫外光区(2)400～760nm的区,(3)2.5～25μm（按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>）的红外光区。

所用为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或）、红外分光光度计或。

为保证测量的和，所有仪器应按照国家或本附录，定期进行校正检定。

仪器组成分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。

常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

仪器主要由光源、单色器、、检测器、信号处理器和显示与组成。

光谱范围包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200～400 nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱光通过三折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.氢灯（或氘灯）的发射光谱:氢灯能发出185～400 nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源.物质的吸收光谱(1)如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.物质的吸收光谱(2)当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收只有一部分光可透过溶液.= 反射光+ 分散光+ 吸收光+ 透过光如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失则:入射光= 吸收光十透过光2原理分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。

样品的吸光值与样品的浓度成正比。

单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：A=-lg(I/I。

)=-lgT=kLc式中:A 为吸光度；基本原理I。

为入射的单色光强度；I 为透射的单色光强度；T 为物质的透射率；k 为吸收系数；L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长c 为物质的浓度物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。

当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。

在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称。

由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。

核酸的定量核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。

可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。

核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。

每种核酸的分子构成不一，因此其不同。

定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。

如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。

测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。

测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。

然而，实验并非一帆风顺。

读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。

灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。

如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。

这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。

另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。

样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的，尤其是核酸样品。

这些小颗粒的存在干扰测试效果。

为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。

在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。

从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。

最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。

纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。

如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。

A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。

纯样品，A320一般是0。