细菌内毒素的检测摘要:本文研究了注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素的检测。

本文是在通过调查大量的科技文献的基础上，按照中国药典2000版二部附录XI E细菌内毒素检查法所规定的试验方法而进行的。

实验方案是根据注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠的细菌内毒素限度，并结合现有的实验条件而确定的。

注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠(Cefoperazone Sodium and Tazuobatanna)为头孢类抗生素头孢哌酮与β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦钠组成的复方注射用无菌粉针，在临床上用于治疗下呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、腹腔盆腔感染、以及其他感染。

质量标准[国家食品药品监督管理局标准（试行）YBH0538 2003]中控制热原的方法仍为家兔热原法，鉴于家兔热原法有影响因素复杂、操作繁琐、检验成本高等缺点，而用细菌内毒素检查法来控制产品中的热原具有操作简便快捷、检验灵敏度高等优点[1]。

为了在大范围内开展本品的细菌内毒素检查，我们对本品进行了细菌内毒素检查凝胶法的研究。

本品细菌内毒素限值为0.15Eu/ml，在1.667至0.400mg/ml的浓度范围内，本品对细菌类毒素与鲎试剂的反应无干扰。

我们对3批样品进行了检验，并与家兔热原法进行对比，结果一致都为阴性，认为本品可用细菌内毒素检查凝胶法代替家兔热原法。

关键词：注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素鲎试剂灵敏度复核试验干扰预试验干扰实验热原检查0引言细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。

其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。

(附图1)附图1 内毒素脂多糖结构示意图<一>、O—特异性链：位于脂多糖分子最外层的多糖链，是由3—5个单糖（一般不多于25个）连成为一个多糖链。

其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等，单糖的种类、位置和排列顺序和空间构型，因菌种不同而异。

因此，它决定菌体热原的特异性。

<二>核心多糖：核心多糖的变异性较小，位于类脂A和0—特异性链（内层）之间，在结构上分为内核心和外核心。

外核心含有数种己糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成。

内核心含有庚糖及特殊的酮糖（3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖KDO）。

这部分结构对不同菌株的LPS基本相似，而且KDO是以不耐酸的酮糖链与类脂A的氨基葡萄糖连接，是构成内毒素脂多糖的核心部分。

<三>类脂A：位于LPS分子结构的外层，是由氨基葡萄糖、磷酸和脂肪酸（10—18C）组成，故称之为糖磷脂，也是细菌外膜的一种，形成单体聚合物。

具有疏水性（强）和亲水性（弱）的双相性。

但是，类脂A可从O-特异链及核心多糖分离出来，游离的类脂A可自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水，并具有生物活性。

所以，类脂A （Lipida）是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。

该基团没有种属特异性，所以各属细菌的类脂A结构相似，其毒性反应相似。

如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血，并导致休克等。

（附图2）附图2 类脂A结构示意图经过大量实验表明，内毒素具有极强的生物学活性，特别是革兰氏阴性菌感染和静脉注射提取的内毒素溶液时，可导致动物体发生内毒素休克和死亡。

内毒素的致病机理，主要是由于革兰氏阴性杆菌（如大肠杆菌、沙门氏杆菌、伤寒杆菌，布氏杆菌、变形杆菌金黄色葡萄球菌等）和其它微生物（病毒、立克次氏体、衣原体螺旋体等）感染时，这类菌属随病灶渗液进入血液循环，并扩散到各种组织器官和体液细胞内繁殖，这类菌属在体内死亡和解体后，才稀放出大量的细菌内毒素脂多糖（LPS），据初步实验表明，当机体内毒素浓度國值 > 0.005ng/ml时,可诱生内源性热原质如肿瘤坏死因子、白细胞介素和β2—干扰素等。

这些因子刺激体温调节中枢导致机体发热，细菌内毒素直接或间接作用于肝脏和胰腺时，可使肝细胞损伤，使糖原异生酶（如葡萄糖—6—6磷酸酶、糖原合成酶）的活性降低，抑制糖原的异生和分解。

同时内毒素作用于胰腺导致胰腺功能障碍，并形成胰岛素抵抗，造成血糖升高致使并发心肌炎和心肌肿大的系列高血糖症状。

所以，革兰氏阴性菌属感染或在病灶中的细菌进入体液细胞繁殖，当其死亡或解体后产生的内毒素，可多次进入血液，引起反复发作，其病理变化极为广泛，几乎所有的器官和组织都可被侵犯，而引起各器官的功能障碍。

其中以网状内皮系统最常见，淋巴、脾、肝、肾、骨髓中均有上皮细胞增生，形成肉芽肿，以肝脏有肉芽肿外，还可发生冲血、水肿和肝细胞坏死，最终导致肝硬化的发生。

其它器官亦有相似的毒性反应。

所以，加强对药品和人体液中的细菌内毒素监测，对确保人体健康具有十分重要的意义。

在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。

细菌内毒素检查法是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成为官方承认的一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。

细菌内毒素检查法所具有的优点表明它比热原检查法更适应现代制药工业的发展。

USPXX版开始收载细菌内毒素检查法，USPXXIII版已有超过90%的注射剂品种规定内毒素检查。

其他国家的药典规定细菌内毒素检查的品种同样经历了从无到有，从少到多的过程。

可以预见，细菌内毒素检查必然会取代绝大多数注射剂品种的热原检查。

[2]USP、EP和JP是三个收载细菌内毒素检查法（BET）较早的药典，它们分别建立了各自的内毒素标准物和BET，WHO为了保持内毒素的国际标准品（IS）的效价（IU）与各国内毒素标准品的效价（EU）一致，进行内毒素IS国际协作研究，自此，内毒素的标准在IU与EU之间实现了统一即1IU=1EU。

虽然内毒素标准初步统一，但在不同的药典方法下测定的内毒素值仍缺乏可比性，不利于医药贸易全球一体化的进程，于是国际协调委员会（ICH）综合USP、EP和JP的BET 方法，通过求同存异，达成了一个国际协调案—统一的BET，统一的BET已收载于USPXXIV版NF19的第二增补本和JP14中。

[2]细菌内毒素检查法在现代工业上日益显示出它的应用价值。

该法用于药品终成品检查，属于药品安全性检查项之一；用于药品生产过程检查，属于一种事前控制的质控手段，对提高药品质量，避免造成药品批报废有重要意义。

细菌内毒素检查还可应用于临床诊断及其他领域。

[2]本文主要研究注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠的细菌内毒素检查凝胶法。

1 实验方法与结果1.1 药物处方组成和药理毒理作用注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠(Cefoperazone Sodium and Tazuobatanna)为复方制剂，其组分为头孢哌酮钠和他唑巴坦钠（4：1）。

本品的抗菌成分为头孢哌酮和他唑巴坦。

头孢哌酮为第三代头孢菌素类抗生素，通过抑制敏感细菌细胞壁的生物合成而达到杀菌作用。

他唑巴坦除对β-内酰胺类抗生素耐药菌株产生的多数重要的β-内酰胺酶具有不可逆性的抑制作用，因而可保护β-内酰胺类抗生素免受耐药菌β-内酰胺酶的水解破坏。

他唑巴坦可防止耐药菌对青霉素类和头孢菌素类抗生素的破坏，并且他唑巴坦与青霉素类和头孢菌素类抗生素具有明显的协同作用。

由于他唑巴坦可与某些青霉素结合蛋白相结合，因此敏感菌株可能对本复方制剂的敏感性较单用头孢哌酮时更强。

两者合用，具有明显的协同作用。

由于舒巴坦可与某些青霉素结合蛋白结合，因此敏感菌株通常对本复方制剂的敏感性较单用头孢唑林时更强。

[性状]本品为白色或类白色粉末或结晶性粉末；无臭，有引湿性1.2 实验方案的设计1.2.1用细菌内毒素试验代替家兔热原试验用于胃肠外药品的专论中不论是细菌内毒素试验或者家兔热原试验都应包括细菌内毒素的毒性剂量要求，通用的原则如下：[3] （1）在任何单一专论中，如果需要试验，通常只包括一个试验，或者检测热原或者检测细菌内毒素。

（2）在没有明显的相反的证据时，首选内毒素检查试验而不是热原试验，因为内毒素检测试验能够为患者提供相等或更好的保护。

家兔热原检查法的优点，可在规定时间里观察到家兔的体温变化，相反反应了热原质引起哺乳类动物复杂的体温反应过程。

所以，在半个多世纪以来热原检查法，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。

但随着制药工业的发展和临床用药的要求，该方法的局限性越来越明显。

这种热原检查法只局限于某种药物进入体内（血循环）是否能引起体温变化或热原反应作为判断药品是否污染热原的方法，已不能满足医药工业发展的需要。

其缺点：a.标准化程度低，无法判断检查样品中存在的热源质到底是什么或是哪一种物质。

b.由于试验动物家兔是处在被细菌污染的环境中，通过吸入或皮肤感染细菌内毒素而被免疫，导致动物的个体差异较大。

c.试验动物受到药品的药理活性干扰，而影响体温变化（如放射性药品、抗生素、生物制品等），试验结果难以判断。

d.设备及实验费用昂贵（如建设动物房、水电、动物饲料等耗费），做一种药品需要280元/次，而鲎试验仅28元/次。

综上情况分析，鲎试验法可避免以上动物热原检查法的不足。

1.2.2测定方法的原则检品中细菌内毒素的存在可能被内毒素和变形细胞裂解物之间的反应干扰因素所掩盖。

因此，如果用细菌内毒素法取代药典规定的家兔热原检查法则必须证明用于该制剂的细菌内毒素法已通过论证试验，也是去除干扰因素的必要步骤。

正如细菌内毒素检查试验中指出的那样，一个用于样品的试验被认为有效必须具备以下两方面的信息[3]。

（1）必须选择适宜的用于试验的物质。

必须确认细菌内毒素检查用水及其它试剂中没有内毒素，必须检查变形细胞裂解物鲎试剂的灵敏度以确认厂家标示的灵敏性。

（2）因为检品可能受到试验的干扰，所以要在有检品和无检品的情况下确定变形细胞裂解物鲎试剂的灵敏性。

这两个灵敏度值必须没有显著差别。

如果有干扰存在，必须进行另一个试验以确认干扰因素是否真被中和或去除了。

1.2.3细菌内毒素检查方法报导的的细菌内毒素检查方法有二十几种,得到官方（美国FDA）批准使用的方法有下述几种：a.凝胶法（Gel-clot），这是目前应用最经典的方法。

b.比色法，包括终点比色法（ECA）和动态比色法（KCA）。

c.比浊法，包括终点比浊法（ETA）和动态比浊法（KTA）。