细菌内毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06起草人：审核人：批准人：批准日期：年月日目录1 概述 12 验证目的及范围 13 验证小组人员组成及职责 14 验证依据 25 验证前准备 26 验证的实施 27 偏差处理 58 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 510 再验证及周期 511 验证文件及归档 512 附件 51 概述细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。

公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。

2 验证目的和方法本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。

3.验证小组人员组成及职责：3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。

3.2 验证小组组成及职责列表4 验证依据《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法5.验证前准备5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。

培训人员记录见附件1。

5.2 确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。

6 验证的实施6.1实验材料及用具6.1.1电子天平6.1.2. 电热干燥箱6.1.3. 恒温恒湿箱6.1.4.水银温度计6.1.5. 旋涡混合器6.1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号）6.1.7.细菌内毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品)6.1.8.细菌内毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用。

6.1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。

6.2实验准备6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。

6.2.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。

达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。

在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。

6.3鲎试剂灵敏度复核试验本试验采用凝胶法，凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测的方法。

6.3.1 细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。

按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。

然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟。

6.3.2 待复核鲎试剂的准备取规格为0.1ml/ 支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。

每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

6.3.3.加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。

4 支（管）4 列每列每支分别加入0.1ml 的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水，作为阴性对照。

6.3.4 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，垂直放入试管架上，连同试管架放入37℃±1℃恒温恒湿箱中，试管架保持水平状态，保温60±2 分钟。

6.3.5 观察并记录结果。

将试管架从恒温恒湿箱中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。

保温和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。

6.3.6实验结果计算如最大浓度2λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。

λc = lg-1 (∑X/4)式中x为反应终点浓度的对数值（lg）。

反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

6.3.7结果判断6.3.7.1.判断标准当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。

6.3.7.2 判断结果：（记录附后）6.4干扰实验6.4.1目的是检验本公司自制的注射用水对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。

使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。

6.4.2 确定最大有效稀释倍数（MVD）注射用水的内毒素限值L为0.25EU/ml，鲎试剂的标示灵敏度为0.25 EU/ml，则最大有效稀释倍数MVD为注射用水本身浓度。

公司如下：MVD=cL/λ式中：L为供试品的细菌内毒素限值c为供试品溶液浓度λ为鲎试剂灵敏度的标示值。

6.4.3制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ（方法同6.3.1）。

6.4.4 制备含内毒素的供试品溶液再注射用水将6.4.3.中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。

6.4.5鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂28支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。

每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

6.4.5加样：按下列表1方法进行加样1)将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。

其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为阴性对照。

2)将另外10支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，每列2支（管）。

其中的4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的标准内毒素溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为样品阴性对照。

加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃恒温恒湿箱中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。

表1 凝胶法干扰试验溶液的准备注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。

6.4.7实验结果计算只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂里面的复核试液要求时，试验方为有效。

当系列溶液B的结果符合鲎试剂里面的复核试验要求室，认为该供试品溶液物干扰作用。

其他情况则认为供试品溶液存在干扰作用。

按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(E s)和用供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(E t).E s= lg-1 (∑X s/4)E t= lg-1 (∑X t/4)X s、X t分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。

6.4.8结果判断6.4.8.1判断标准当E s在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且E t在0.5 E s～2.0E s（包括0.5 E s和2.0E s）时，则认为该供试品溶液不干扰实验，可对此供试品进行细菌内毒素检查。

当E t不在0.5 E s～2.0E s（包括0.5 E s和2.0E s）时，则认为该供试品溶液干扰实验。

6.4.8.2判断结果：（记录附后）。

6.5供试品的凝胶限度试验检查6.5.1 在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。

6.5.2 凝胶限度溶液的制备：按表2进行各试验溶液的制备表1 凝胶限度试验溶液的制备注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。

6.5.2.1 供试品溶液的制备：取公司自制的注射用水，不需进行稀释处理。

6.5.2.2阳性对照溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液（方法同6.3.1）。

6.5.2.3供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。

（方法同6.4.4制备含内毒素的供试品溶液）。

6.5.2.4阴性对照液用细菌内毒素检查用水6.5.3鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。

每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

6.5.4 加样取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支（A）加入0.1ml供试品溶液作为供试品管，2支（B）加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管，2支(C)加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管，2支(D)加入0.1ml检查用水作为阴性对照管。

6.5.5 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温恒湿箱中，保温60±2分钟。

保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

6.5.6结果判断6.5.6.1判断标准若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。

若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。

若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。

若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，一管为阴性，需进行复试。