实验四沙门氏菌属（Salmonella）的检验1 目的1.1 理解沙门氏菌属生化反应及其原理1.2 掌握沙门氏菌属血清因子使用方法1.3 掌握沙门氏菌属的系统检验方法2 原理沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。

种类繁多，少数只对人致病。

其他对动物致病，偶尔可传染给人。

主要引起人类伤寒，副伤寒以及食物中毒或败血症。

在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。

食品中沙门氏菌的检验方法有五个基本步骤：1 前增菌；2 选择性增菌；3 选择性平板分离沙门氏菌；4 生化试验，鉴定到属；5 血清学分型鉴定。

目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位。

本实验以蛋品为检测样品，以已知的沙门氏菌和大肠埃希氏菌为对照。

3 材料3.1 菌种沙门氏菌（Salmonella sp.）大肠埃希氏菌（E.col.）3.2 检样冻肉、蛋品、乳品等。

3.3 培养基缓冲蛋白胨水（BP）、氯化镁孔雀绿（MM）增菌液、四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、SS琼脂、EMB琼脂、亚硫酸铋琼脂（B S）、三糖铁琼脂（TSI）、蛋白胨水、尿素培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、鸟氨酸脱羧酶试验培养基、丙二酸钠培养基、氰化钾（KCN）培养基、ONPG培养基、缓冲葡萄糖蛋白胨水、DHL琼脂、HE琼脂。

3.4 试剂吲哚试剂、V-P试剂、甲基红试剂、氧化酶试剂，沙门菌A—F多价诊断血清，革兰氏染色液等。

3.5 器具天平（称取检样用）、均质器或乳钵、显微镜、广口瓶、三角烧瓶、吸管、平皿、金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架。

4 流程5 步骤5.1 前增菌和增菌沙门氏菌在食品加工过程中，常常受到损伤而处于濒死状态，因此经过加工的食品检验沙门氏菌时应进行前增菌，即用不加任何抑菌剂的培养基缓冲蛋白胨水（BP），进行增菌，使濒死状态的沙门氏菌恢复活力。

一般增菌时间为4h，增菌时间不宜过长，由于BP培养基中没有抑菌剂，时间太长了，杂菌也会相应增多。

干蛋品特殊，蛋品中的主要病原菌为沙门氏菌，其在加工过程中受到的损伤又较严重，因此应适当延长前增菌时间，一般为18～24h。

无菌操作称冻蛋取25g样品，加入盛有225mL灭菌缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内（瓶内预放玻璃珠若干粒），塞紧瓶口，充分摇匀。

在36±1℃培养4h（干蛋品需培养13～24h），移10ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液，在42℃培养18～24h。

同时另取10ml，加入100ml亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液内，在36±1℃培养18～24h。

鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。

各取25g（25ml）加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液，取半量，接种于100mLMM（或TTB）增菌液内，于42 oC培养24h；另半量接种于100mLSC增菌液内，于36±1 oC培养18～24h。

5.2 分离取增菌液和混合液各1环，分别划线接种于一个BS平板和一个DHL琼脂平板（或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板）。

于36±1 oC培养18～24h（DHL、H E、WS、SS）或40～48h（BS），观察各个平板上生长的菌落。

先观察混合菌种平板，再检查样品平板上有无可疑菌落，挑取菌种平板和样品平板上的可疑菌落进行革兰氏染色与镜检。

5.3 三糖铁高层琼脂初步鉴别将上述革兰氏阴性杆菌的可疑菌落，挑取数个接种一支三糖铁高层琼脂斜面，于36±1 oC培养18～24h，并根据表4-1初步判断是否可疑沙门氏菌。

表4-1肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种－＋ ±＋沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌＋＋ ±＋沙门氏菌Ⅱ、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌－＋＋－沙门氏菌属、大肠艾希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属－＋－－伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠艾希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属＋＋ ±－大肠艾希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌注：+阳；－阴性；＋／－多数阳性，少数阴性。

5.4 生化试验在接种三糖铁琼脂的同时，接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7. 2）、氰化钾（KCN）培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管，于36±1 oC培养18～24h，必要时可延长至48h，按表4-2判定结果。

按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其它5种反应结果均可以排除。

表4－2 肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表反应序号 H2S 吲哚 PH7.2尿素 KCN 赖氨酸脱羧酶判定菌属A1 ＋－－－＋沙门氏菌属A2 ＋＋－－＋沙门氏菌属(少见)爱德华氏菌A3 ＋－＋＋－柠檬酸杆菌奇异变形杆菌A4 ＋＋＋＋－普通变形杆菌B1 －－－－－－－－＋－沙门氏菌属、埃希氏菌甲型副伤寒沙门氏菌、埃希氏菌、志贺氏菌属B2 －－＋＋－－－－＋－埃希氏菌埃希氏菌、志贺氏菌属B3 －－－－ ±＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、柠檬酸杆菌属B4 －＋ ±＋－摩根氏摩根氏菌、普罗菲登斯菌属注：①三糖铁琼脂底层均产酸；不产酸者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。

②KCN和赖氨酸可选用其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。

③＋表示阳性；－表示阴性；±表示多数阳性，少数阴性。

5.4.1 反应序号A1典型反应判定为沙门氏菌属。

如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，按表4-3可判定为沙门氏菌。

如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。

表4－3 沙门氏菌属生化鉴别表PH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸判定结果－－－甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）＋－＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：＋表示阳性；－表示阴性。

5.4.2 反应序号A2可先作血清学鉴定，如A～F多价O血清不凝聚时，补做甘露醇和山梨醇试验，按表4-4判定结果。

表4-4甘露醇山梨醇判定结果＋＋沙门氏菌靛基质阳性变种（要求血清学鉴定结果）－－爱德华氏菌5.4.3 反应序号B1三糖高层斜面产酸的菌株可予以排除，不产酸的应该先作血清学鉴定。

如A～F 多价O血清不凝聚时，补做鸟氨酸、ONPG，水杨苷、棉子糖和半动力试验。

按表4-5 判断结果。

必要时按表4-6进行沙门氏菌生化群的鉴别表4－5 沙门氏菌属各生化群的鉴别赖氨酸鸟氨酸 ONPG 水杨苷棉子糖动力判定结果＋＋－－－＋沙门氏菌－－－－－－志贺氏菌属－＋＋－－－宋内氏志贺氏菌属d d d d d d 埃希氏菌属注：＋表示阳性；－表示阴性。

表4－6 沙门氏菌属各生化群的鉴别项目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ卫矛醇＋＋－－＋－山梨醇＋＋＋＋＋－水杨苷－－－＋－－ONPG －－＋－＋－丙二酸盐－＋＋－－－KCN －－－＋＋－注：＋表示阳性；－表示阴性。

5.5 血清学分型鉴定5.5.1 抗原的准备一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如 2.5%～3%）培养基上检查，O抗原在干燥环境中发育较好；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。

H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%～0.8%半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3～0.4%半固体琼脂的小玻管1～2次，自远端取菌培养后再检查。

5.5.2 O抗原的鉴定用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。

在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。

被A～F多价O血清凝集者，一次用O4、O3.10、O7、O8、O9、O2和O11因子血清做凝集试验。

根据试验结果，判定O群。

被O3.10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O 单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。

不被A～F多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。

每种多价O血清所包括的O因子如下：O多价1 A，B，C，D，E，F群（并包括6，14群）O多价2 13，16，17，18，21群O多价3 28，30，35，38，39群O多价4 40，41，42，43群O多价5 44，45，47，48群O多价6 50，51，52，53群O多价7 55，56，57，58群O多价8 59，60，61，62群O多价9 63，65，66，67群5.5.3 H抗原的鉴定属于A～F各O群的常见菌型，依次用表7所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。

表4-7 A～F群常见菌型H抗原表O群第1相第2相A a 无B g，f，s 无B i，b，d 2C1 k，v，r，c 5，Z15C2 b，d，r 2，5D（不产气的） d 无D（产气的） g，m，p，q 无E1 h，v 6，w，xE4 g，s，t 无E4 i不常见的菌型，先用163种沙门氏菌因子血清中的8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以确定第1相和第2相的H抗原。

8种多价H血清所包括的H因子如下：H多价1 a，b，c，d，iH多价2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gq，mt，gz51H多价3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40H多价4 1，2；1，5；1，6；1，7；z6H多价5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38H多价6 z39，z41，z42，z44H多价7 z52，z53，z54，z55H多价8 z56，z57，z60，z61，z62每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。

检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。

如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。

单相菌不必作位相变异检查。

5.5.4 Vi抗原的鉴定用Vi因子血清检查。

已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林伤寒沙门氏菌。

6 结果综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照表或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型，并报告结果。