分子生物学实验教材：参考书：《分子克隆实验指南》（第三版）黄培堂等译科学出版社实验一﹑大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一.[目的要求]通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。

二.[实验原理]细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

细菌处于0︒C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42︒C 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Amp+得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。

三.[教学内容]1.感受态细胞的制备基础知识及方法简介2.CaCl2法制备DH5α或JM109感受态细胞，计算转化效率3.pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞四.[实验材料和用品]E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA，eppendorf管。

超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、平皿、LB培养基、CaCl2 溶液、氨苄青霉素、等五.[实验步骤]一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

三、转化1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

2、加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。

3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。

5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

同时做两个对照:对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。

此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

六.[结果与分析]１．计算转化率。

２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。

七.[问题与讨论]：１．根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？２．抗性法筛选原理是什么？实验二﹑质粒DNA的提取和酶切一.[目的要求]1、通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术2、学习和掌握酶切的相关知识和操作二.[实验原理]碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。

在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三.[教学内容]1.质粒载体基础知识、多种质粒提取方法的介绍2.碱裂解法提取载体质粒、含目的片段质粒3.根据需要EcoRI、BamHI、XhoI酶切所提取的质粒,包括部分酶切和完全酶切四.[实验材料和用品]恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Enpendorf管、含pUC19、pGEX质粒及含目的基因质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、EcoRI、BamHI、XhoI 等限制性内切酶五.[实验步骤]见教材六.[结果与分析]质粒DNA OD260,OD280的值，由此计算质粒DNA得率和ＤＮＡ纯度。

七.[问题与讨论]1.简述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用及加入后的现象.2.简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因.3.简述影响酶切的因素.实验三﹑琼脂糖凝胶电泳检测DNA一﹑[目的要求]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术二﹑[实验原理]DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。

三﹑[教学内容]1.电泳基本知识介绍2.琼脂糖凝胶的制备3.电泳检测质粒DNA及其部分酶切和不完全酶切的产物4.质粒及其酶切产物的定量四﹑[实验材料和用品]恒温培养箱、台式离心机、高压灭菌锅、水平电泳系统、紫外透射仪、TAE电泳缓冲液、EB、加样缓冲液、琼脂糖等五.[实验步骤]见教材六.[结果与分析]在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶,并估计DNA样品量.七.[问题与讨论]影响凝胶电泳结果的因素有哪些?实验四﹑ DNA片段的回收一﹑[目的要求]通过本实验学习低熔点琼脂糖法、苯酚法和玻璃粉法等回收和纯化目的DNA片段的方法和技术二﹑[实验原理]在电泳过程中不同大小的片段分离处于不同的位置，切下并回收含目的片段的琼脂糖凝胶，经抽提、浓缩即可获得目的片段。

三﹑[教学内容]1. 介绍多种纯化、回收DNA的方法和技术2. 低熔点琼脂糖法回收和纯化PCR扩增的DNA片段3．苯酚法或玻璃粉法回收和纯化PCR扩增的DNA片段四﹑[实验材料和用品]台式离心机、水平电泳仪、-20 C冰箱、低熔点琼脂糖、玻璃粉回收DNA试剂盒、苯酚等五.[实验步骤]见教材六.[结果与分析]１．计算ＤＮＡ回收效率，判断ＤＮＡ纯度。

２．记录电泳结果七.[问题与讨论]１．电洗脱过程后，为什么要反向电泳１分钟？２．电洗脱后的ＤＮＡ如何去除ＥＢ？实验五﹑植物基因组DNA提取及检测一﹑[目的要求]1.学习植物DNA分离的原理2.掌握植物基因组DNA提取的方法3.了解植物基因组DNA提取与动物基因组DNA提取方法的不同二﹑[实验原理]利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞.细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来.EDTA抑制DNA酶的活性.再用酚﹑氯仿抽提的方法去去除蛋白,得到的DNA溶液经乙醇沉淀.三、[教学内容]1.材料的选择2.介绍细胞破碎的不同方法3.DNA的提取4.DNA纯度的鉴定四﹑[实验材料和用品]低温离心机,恒温水浴锅,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统;Tris,EDTA,NaCl,β巯基乙醇,等;细胞提取液(100mmol/L Tris.HCL pH8.0 ,5mmol/L EDTA pH8.0 ,500mmol/LNaCl ,1.25% SDS ,1mol/L β巯基乙醇);5mol/L KCl ;TE.五.[实验步骤]见教材六.[结果与分析]提取到的DNA应为一条带,若DNA降解会出现弥散带型.七.[问题与讨论]本实验DNA带型与质粒DNA带型有什么不同,为什么?实验六 PCR基因扩增一﹑[目的要求]通过本实验学习PCR反应的基本原理和实验技术二﹑[实验原理]多聚酶链式反应类似DNA分子的天然复制过程。

在待扩增的片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

三﹑[教学内容]1.PCR 原理和多种PCR方法及其应用介绍2.学习引物的设计3.利用PCR技术扩增一已知的基因片段4.电泳检测PCR产物四﹑[实验材料和用品]PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳系统、DNA模板、引物1、引物2、dNTP、Taq酶、Eppendorf管等五.[实验步骤]见教材六.[结果与分析]琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,分析结果.七.[问题与讨论]PCR引物设计时应注意哪些问题?实验七﹑ DNA重组及鉴定一﹑[目的要求]通过本实验学习重组DNA连接及鉴定重组子的方法。

二﹑[实验原理]外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。

重新组合的DNA 分子是在连接酶的作用下进行连接的。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。

如利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。

当外源基因插入lacZ基因中的多克隆位点后，将形成白色菌落从而与未插入外源基因的兰色菌落相区别。

三﹑[教学内容]1.DNA重组知识介绍2.分别回收纯化的外源DNA与酶切的载体分子并定量3.按一定比例用T4噬菌体DNA连接酶进行连接反应。

4.介绍阳性克隆子的鉴定方法和技术5.利用氨苄青霉素抗性6.α互补现象7.PCR法8.酶切法进行阳性重组子的筛选四﹑[实验材料和用品]低温水浴锅、冰箱、T4连接酶、外源DNA与酶切的载体﹑超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、酶、IPTG、X-gal、LB培养基、氨苄青霉素等五.[实验步骤]见教材六.[结果与分析]观察菌落长出情况,并对结果进行分析.七.[问题与讨论]1.影响酶切效率的因素有哪些?2.试述重组子鉴定的原理.实验八外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测一﹑[目的要求]通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白二﹑[实验原理]将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。

先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。

然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。