5’
3’
DNA的体内复制
DNA解 旋解链 引物 合成
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG 引物酶 5’
RNA引物 RNA引物
3’
5’ 引物酶 3’
AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
5’
DNA的体内复制
DNA解 旋解链 引物 合成 新链 延伸
3. 如何检测杂交信号？
同位素标记物： 盖革计数器、液体闪烁计数器 放射自显影(autoradiography)
如何检测杂交信号？
非放射性标记物： 酶联免疫技术(enzyme linked immuno-assay) 化学发光(chemiluminescence)
三、如何对核酸探针进行标记？
一、基本原理
变性(denature) 复性(renature) 杂交(hybiridization)
核酸变性
在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程 破坏氢键与疏水作用可导致变性
热变性：高温可使核酸变性，温度高于 90℃时 任何核酸双链都将变性 酸碱变性：pH<3 或 pH>11 时核酸将变性，DNA 使用碱变性，RNA 则不可 化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素 或甲酰胺可使核酸变性
一、PCR 的基本原理
在体外，以特定引物引 导，通过 DNA 聚合酶 选择性扩增特定区域 变性(denature)
退火(anneal) 延伸(extension)
DNA的体内复制
DNA解 旋解链
5’
3’
Байду номын сангаас
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 解旋酶解链酶 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
Taq
Taq
Taq
第2轮结束
第1轮扩增 模板DNA 第2轮扩增
第3轮扩增
重复30轮后 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 230=1,073,741,824
n 循环次数
理想拷贝数=2n
实际拷贝数=(1+x)n
X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
DNA的体外扩增
1 2 3
高温变性 低温退火 适温延伸
5’ 3’
变性 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’ 5’
加 热 退 火
复性
94℃
模板DNA
55℃
引物1
DNA引物
引物2
72℃
Taq酶
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
94℃
第2 1轮开始 轮结束
Taq
55℃ 72℃
引物的解链温度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)
引物设计原则
引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现 发卡结构
两条引物间、同一引物的分子间不应存在互补序列
二、做 PCR 要有什么条件？
酶：Taq DNA 聚合酶
模板 DNA：可以为基因组 DNA 或 cDNA 引物：人工合成的寡核苷酸片段 dNTP：聚合反应的核苷酸单体 缓冲液：包含特定的 pH、离子强度和 Mg2+
反应程序：变性、退火、延伸组成的循环
仪器：DNA 热循环仪，或称 PCR 仪
反 Northern 杂交与 DNA 芯片
反 Northern 杂交：将探针 DNA 片段固定在杂交膜 上，利用标记物标记的 RNA 进行杂交
第二节：聚合酶链式反应
PCR，polymerase chain reaction
在体外选择性扩增特定 DNA 片段的高效手段 70 年代有人提出 PCR 的设想，因缺乏寡核苷酸的 合成手段和适合的酶而无法进行 1984 年 Kary Mullis 发明 PCR，并因此获得 1993 年的诺贝尔化学奖 全自动的热循环仪和多种 PCR 衍生技术使其成为 重要的科学研究手段
1. 探针有哪些种类？
DNA 探针：常规探针 利用基因组 DNA 序列或 cDNA 序列合成的探 针，一般为双链，也可制备成单链 RNA 探针：高灵敏度探针 一般是通过体外转录而来，均为单链 寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测 人工合成的短序列(~20nt)，可自由选择序列
变性温度
Tm：melting temperature，解链温度或变性温度 影响变性温度的因素： 溶液的离子强度 变性温度与离子强度
正相关，低盐利于变性
DNA分子的 GC 含量 GC％＝(Tm－69.3)×2.24
核酸复性
变性的 DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然双 螺旋结构的过程 复性类似与化学反应，需要一定反应时间
2. 标记物有哪些？
标记物的要求： 高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列 高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检 测到特异的靶序列 标记物的种类： 放射性同位素(radio isotope) 非放射性标记物(non-radioactive label)
放射性同位素
特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微 量的核酸序列 g→mg→μg→ng→pg→fg 常用的放射性同位素
dNTP
DNA聚合酶催化的聚合反应
1. 什么是耐热 DNA 聚合酶
早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I
在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶 延伸反应温度为 37℃，非特异性太多 目前常用 Taq DNA 聚合酶 纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高温，最适反应温度为 72℃ 左右
热 循 环
温 度 72 （℃）
94
重复1-3步 25-30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
DNA 解 链
DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋 新链延伸
55 22
1
2
3
时间（min）
4
5
DNA的体外扩增
PCR反应体系
4种dNTP混合物 各200 µ mol/L 引物 各0.1-0.5 µ mol/L 模板DNA 0 .1 ～ 2 µ g Taq DNA聚合酶 2.5 U Mg2+ 1.5mmol/L
有保真性的耐热 DNA 聚合酶吗？
Pfu DNA polymerase：
常用的高保真耐热 DNA聚合酶 有5’ →3’ 外切活性 错误率约 1×10－6 适应于基因克隆
2. 如何设计寡聚核苷酸引物？
引物(primer)是 PCR 反应必备的前提，对 PCR 产物 类型、长度和反应的特异性具有决定作用
第四篇：分子生物学技术与应用
第19章：分子生物学常用技术－－4学时
分子杂交、PCR、基因测序
蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交)
基因转移与基因剔除(含RNA干扰) 第20章：基因工程－－4学时 第21章：基因诊断与基因治疗－－4学时
第十九章
分子生物学常用技术
分子生物学技术能帮助我们干什么？
dot hybridization
将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交 特点：简便但特异性不高 可探测核酸含量，但无法得知分子大小
Southern blot
Edwin Southern 创立的方法 电泳技术与杂交结合，可显示靶 DNA 序列的长度 可进行毛吸管转移、真空转移与电转移
影响 DNA 复性速度的因素
DNA 分子的浓度：浓度高，复性快
DNA 分子的长度：长片段复性速度慢 DNA 分子的复杂性：重复序列复性速度快
不同物种C0t曲线比较 人类基因组C0t曲线
二、核酸探针
Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列
探针为 DNA 或 RNA，可以为单链或双链 探针必需经过标记：放射性标记或非放射性标记
电泳
转膜
杂交
Northern blot
类似于 Southern 印迹杂交的方法，用于 RNA 检测
in situ hybridization
原位杂交：特定 mRNA 的组织细胞分布
FISH
Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基 因的染色体定位
PCR 需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段 长度
引物设计原则
引物长度一般为 15~30 核苷酸 引物太短影响杂交体的稳定和特异性 引物太长随机匹配序列增多，特异性反而下降 GC 含量一般为 40％ ~ 60％ 应充分考虑退火温度(annealing temperature) GC 含量低，退火温度低，易出现非特异 GC 含量高，非特异性结合也会增加 引物解链温度粗略计算公式：
样品(DNA or RNA)吸附于支持物 尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等 与标记的探针杂交 封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行 缓冲液清洗 控制温度与变性剂浓度 显色 放射自显影/酶联显色
五、杂交有哪些不同的方式？
斑点杂交：dot hybridization Southern 印迹杂交：Southern blot Northern 印迹杂交：Northern blot Western blotting：不是杂交 原位杂交：in situ hybridization 反 Northern 印迹杂交：reverse Northern blot 基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNA microarray
揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能
DNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位 RNA 水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析 蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能 细胞与整体水平：基因在活体中的功能 目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段