咖啡酸苯乙酯靶向调控人结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号通路的研究梁路昌1唐志晗1 李珍发2万剑2薛文1王军1涂宏2何葵2*（1.南华大学湖南衡阳421001；2.衡阳市中心医院湖南衡阳421001）[摘要]目的：探讨咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)对结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号传导通路中相关蛋白表达的作用，寻找其作用靶点，试图阐明CAPE抗肿瘤作用的分子机制。
方法：用不同浓度CAPE处理HT-29细胞，利用Hoechst33258染色法和流式细胞术，检测细胞凋亡的发生。
应用Western-blot法分析不同浓度CAPE对HT-29细胞中FAK、ERK蛋白表达的影响。
结果：Hoechst33258染色发现CAPE作用后凋亡细胞数量增加。
流式细胞仪细胞凋亡率分析显示，0、2.5、5.0、7.5、10μg/ml处理HT-29 细胞24h后，细胞凋亡率上升，呈剂量依赖性。
Western印迹结果显示：在（0-10）μg/ml范围内不同浓度CAPE作用于HT-29细胞24h后，FAK、ERK蛋白表达随CAPE浓度的增加而下调。
结论：CAPE可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡，其作用机制可能与CAPE 抑制FAK-ERK信号转导通路的激活有关。
[关键词] 咖啡酸苯乙酯；结肠癌细胞HT-29；细胞凋亡；黏着斑激酶；细胞外信号调节激酶；免疫蛋白印迹Caffeic acid phenethyl ester induces growth arrest and apoptosis of HT-29 colon cancer cells by inhibition FAK /ERK signal transductionpathwayLIANG Lu-chang1,TANG Zhi-han1, LI Zhen-fa2, WAN Jian2, XUE Wen1, WANG Jun1, TU Hong2, HEKui 2*（1.Nan-hua University; Hengyang 421001，China；2.The Central Hospital of Hengyang，Hengyang 421001）［Abstract］Objective: To explore the effects of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on expression of the related proteins in FAK-ERK signal transduction pathway in colorectal carcinoma cell line HT-29, to find out the targets CAPE targeted and to elucidate furtherly the anti-tumor mechanism of CAPE. Methods: The cells of human colorectal carcinoma cell line HT-29 were treated with CAPE at different concentration. Flow cytometry(FCM)and Hoechst33258 staining were used to detect apoptosis. Western blotting analysis was used toevaluate the protein level of FAK-ERK in HT-29 cell treated by CAPE. Results: Hoechst33258 staining showed that apoptosis cells increased after the treatment of CAPE; The results of FCM analysis showed that cell apoptosis rate increased after exposed to CAPE in a dose dependent manner (0, 2.5, 5.0, 7.5 and 10μg/ml ) after 24 h.Western blot analysis showed that the expression of FAK-ERK protein in HT-29 cells was down-regulated with the increase of CAPE concentrations from 0 to10 μg/ml. Conclusions: CAPE can induces the colorectal carcinoma cell line HT-29 apoptosis. The mechanism of the role of CAPE may be suppress FAK-ERK signal transduction pathway activation.[Key words] Caffeic acid phenethyl ester; colorectal cell HT-29; Cell apoptosis; Focal adhesion kinase; Extracellular signal-regulated kinase; western-blot[基金项目] 湖南省科技厅课题项目（S2009F1023）[作者简介] 梁路昌（1985-），男，硕士研究生，研究方向为大肠癌的预防和治疗*通讯作者：何葵，博士，主任医师，E-mail: hekui@CAPE是一种酚类抗氧化剂，是存在于蜂胶中的一种主要活性组份，具有广泛的生物学活性，抗炎、抗肿瘤、免疫调节以及抗氧化等作用[1]。
研究发现，CAPE能诱导白血病、胆管癌、大肠癌细胞、神经胶质瘤细胞株U251、胰腺癌等多种肿瘤细胞凋亡[2-6]。
我们前期研究发现CAPE能抑制HT-29细胞增殖、诱导其凋亡[7]。
但是，CAPE抑制结肠癌细胞增殖、凋亡的分子机制复杂。
近年研究发现，FAK-ERK信号转导通路参与了细胞增殖、分化、生存、迁移、凋亡和恶变等多种生物学反应，此通路的异常活化可能是肿瘤发生的机制之一[8-11]。
CAPE是否通过调节细胞内FAK-ERK信号转导通路来诱导结肠癌的增殖、凋亡尚不清楚。
因此，我们用不同浓度的CAPE处理HT-29细胞，采用Hoechst33258染色法和流式细胞术等方法检测细胞凋亡的发生，并观察HT-29细胞内的FAK和ERK的蛋白表达变化情况，试图探讨CAPE抑制HT-29细胞增殖、诱导凋亡的分子机制。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞来源与细胞培养HT-29细胞系购自中南大学湘雅医学院细胞中心，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640 培养基，置37℃ 5%CO2培养箱中贴壁培养，隔日换液，待细胞75%融合时，按1:2或1:3传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
1.1.2 药品与试剂CAPE为ALEXIS公司产品；RPMI1640培养基为GIBCO公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品，细胞胰酶消化液、DMSO购自天津灏洋生物公司；Hoechst33258染色试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、Western印迹及IP细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒)为碧云天生物技术研究所产品；PVDF膜、FAK、ERK（均为鼠抗人）为MILLIPORE公司产品；鼠抗人β-Actin一抗购自Auragene公司，HRP标记的羊抗小鼠二抗为Jackson公司产品。
1.2 方法1.2.1 Hoechst33258染色荧光显微镜观察Hoechst33258染色观察HT-29 细胞凋亡核形态学变化。
取对数生长期HT-29细胞以1×105个/ml接种于六孔板中进行细胞爬片。
培养24h后，实验组加入CAPE（10μg/ml），对照组加相同体积的培养基，继续培养24h。
弃上清，PBS漂洗2次，每次3min，加入固定液0.5 ml，4℃固定10 min，弃固定液，PBS 洗2次，每次3min，滴加Hoechst33258工作液0.5ml，室温染色10min，PBS洗2次，滴一滴抗荧光淬灭封片液于6孔板板中的盖玻片上，置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.2 细胞凋亡率分析取对数生长期的HT-29以1×106个/瓶板接种于75ml培养瓶培养，24h后吸除原培养液，加入不同浓度的CAPE；培养液中不加药物（加相同浓度的DMSO）的为对照组，继续培养24h后分别收集细胞，1000r/min，4℃离心5min后，冷PBS重悬，离心，弃上清，再次重悬离心，加5μl Annexin-V-FITC溶液和2.5μl PI到100μl细胞悬浮液中，混匀后避光反应10min，加150μl样品稀释液到样品中，混匀后上机检测。
1.2.3 Western印迹检测各蛋白表达将HT-29细胞经浓度分别为2.5、5.0、7.5、10μg/ml 的CAPE处理后,继续培养24h后收集细胞,常规提取细胞总蛋白。
取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳(分离胶浓度为8%和10%,积层胶浓度为5% )。
电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭4h后，加入一抗FAK（1:1000）、ERK（1:500），4℃孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的羊抗小鼠二抗（1:2000），室温下摇床孵育2h。
以ECL试剂盒显色。
X 光片感光，显影。
ImagerJ软件分析条带灰度值。
1.3 统计学处理x s表示。
采用SPSS 13.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素本实验数据以方差分析(One Way ANOV A)，组间比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 Hoechst33258染色荧光显微镜观察凋亡细胞荧光显微镜下，对照组中细胞形态饱满，细胞DNA 分布相对均匀，核无固缩，呈现体积较大的，均匀蓝色荧光，核形态规则，为圆形或椭圆形（图1A ）；10μg/ml CAPE 处理细胞24 h 后，细胞体积变小，凋亡细胞核浓聚呈斑块状聚集致密浓染，胞内可见致密的亮蓝色强荧光（图1B ）。
2.3 CAPE 对HT-29细胞凋亡的影响对照组自然凋亡率为3.5 ± 0.4%，5.0、7.5、10μg/ml CAPE 作用HT-29细胞24h 后的凋亡率分别为10.4 ± 0.6%、13.8 ± 0.9%、19.8 ± 1.1%，结果相比较差异有统计学意义（P<0.05、P<0.01）。