重组汉逊酵母乙肝疫苗生产工艺
菌 种
小三角瓶 大三角瓶
种子发酵罐
生产发酵罐 细胞破碎
去除细胞碎片 疏水层析 离子交换层析 凝胶过滤 除菌过滤 铝 吸 附
种子批系统 SEED LOT SYSTEM
• 在乙肝疫苗的 生产过程中采用种子批
系统，即由原始种子批制备主代种子批， 由主代种子制备工作种子批，每次发酵 都由工作种子批中取一支菌种接种三角 瓶.种子批保存在液氮或－80℃的冰箱 中。其目的是为了批与批之间菌种的差 别降至最低。
阳性
阴性
5
阴性
阴性
41
结论： 阻断母婴传播的效果好，保
护率达到较高水平，（95,07%）。
由于重组汉逊酵母表达水平高，使重组汉逊酵
母乙肝疫苗含有足够量的抗原，抗原浓度比其 它乙肝疫苗高出一倍，成人：20ug/ml,婴儿， 儿童：10ug/0,5ml。因而，免疫后产生的抗体 不仅滴度高，而且抗体持续时间长。
免疫球蛋白（Immune Globulin) 免疫球蛋白是将HBsAg阴性供血者的血液 经低温乙醇分段法而制成，其中anti—HBs 的含量不确定，所以预防乙型肝炎病毒感 染的作用也是不明确的。使用免疫球蛋白 的唯一理由是当时无法获得特异性乙肝免 疫球蛋白（HBIG）
乙型肝炎病毒感染的预防：
特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG） 特异性乙肝免疫球蛋白是将anti-HBs 阳性供血者的血液经低温乙醇分段法而 制成，其中anti—HBs的含量是确定的， 所以对乙肝病毒暴露后的预防作用也是 确定的。经低温乙醇分段法而制备的特 异性乙肝免疫球蛋白是安全的，没有证 据表明它会传播AIDS。
• 10, 大连高新（汉信）生物制药有
限公司从 1998 年开始重组汉逊酵 母乙肝疫苗的研制工作，在 2002 年 6 月获得了国家药品监督管理局 颁发的“新药证书”，在 2003 年 开始商业化生产。 • 11 , 华兰生物在 2009 年也将开始 重组汉逊酵母乙肝疫苗的生产。
乙肝疫苗的发展历史
其结果如下：
重组汉逊酵母乙肝疫苗 免疫新生儿后的抗体反应
母 亲 新生 儿数 HBsAg HBeAg + + 45 抗-HBs 阳转率（%） 3个月 91,11 41/45 100,0 4/4 85,37 35/41 7个月 93,33 42/45 100,0 5/5 100,0 41/41 抗-HBs GMT 3个月 236,6 7个月 615,5
乙肝抗原的来源
• 1，乙肝患者的血液：血源性乙肝
疫苗。 • 2，利用DNA重组技术构建重组微 生物（酵母）表达（合成）乙肝抗 原：基因工程乙肝疫苗
•
•
•
乙肝疫苗发展历史 1, 1963年Blumberg发现在血友病患者的血 清中存在一种抗体，这种抗体能与澳大利亚 土著人血液中的一种抗原起交叉反应，这种 抗原被命名为“澳大利亚”抗原。 2, 1968 年 Prince 在血清型肝炎（乙型肝炎） 患者血清中发现抗原性与澳大利亚抗原相同 的病毒样颗粒，进而初步认定澳大利亚抗原 就是乙肝表面抗原。 3, 1970年 Dane用电子显微镜在乙肝患者血 清中发现直径为42nm完整乙肝病毒颗粒及直 径为22nm的球形和杆形的乙肝表面抗原。
特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）的使用
• 什么情况下使用特异性乙肝免疫球蛋白
（HBIG） • 1，伤口和黏膜意外暴露于HBsAg—阳性血 液。 • 2, HBsAg—阳性母亲所生的新生儿。 • 注意：在注射特异性乙肝免疫球蛋白 （HBIG）后，还应同时注射乙肝疫苗。
苗）。1995年停产。 n80 年代中期 ---- 基因工程乙肝疫苗（第二代乙肝 疫苗）。包括： • 重组酿酒酵母乙肝疫苗，表达水平不理想— 50mg/L 。 5ug/0,5ml的成人剂量偏低，抗体滴度 偏低。 • 重组CHO细胞乙肝疫苗，表达水平低，2-5mg/L， 母婴阻断效果不理想 • 重组牛痘病毒乙肝疫苗。表达水平低，1-3mg/L， 无法实现工业化生产。 n90年代初期---重组汉逊酵母乙肝疫苗。更先进的 基因工程乙肝疫苗。
• 8, 1989 年 北 京 生 物 制 品 研 究 所 与
Merck 公司签订合同，引进重组酵母 乙肝疫苗工业化生产技术。 1993年 5 月开始试生产。 • 9, 90年代德国莱茵生物技术公司发展 了一种甲基营养型酵母 ---汉逊酵母表 达系统,其乙肝表面抗原表达水平可达 到 500-1000mg/L. 南韩绿十字疫苗 公司应用该表达系统实现了重组汉逊 酵母乙肝疫苗的大规模工业化生产。
+
-
5
223,9
677,3
-
-
41
344,3
634,5
重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫新 生儿的阻断母婴传播保护效果
母 亲 人数 HBsAg阳转率 保护率
HBsAg HBeAg 阳性 阳性 45
3个月 2,22 (1/45) 0,00 (0/4) 2,44 (1/41)
7 个月 4,44 (2/45) 0,00 (0/4) 0,00 (0/41) 95,07%
国内主要的乙肝疫苗生产厂家
厂家 疫苗 北京天坛生物制品 重组酿酒酵母乙肝疫 股份有限公司(北京 苗 生物制品研究所） 深圳康泰生物制品 公司 华北药厂和长春生 物制品研究所等 大连高新(汉信）公 司 和华兰生物疫苗 重组酿酒酵母乙肝疫 苗 重组CHO细胞乙肝 疫苗 重组汉逊酵母乙肝疫 苗
国内乙肝疫苗生产厂家工艺比较
• 北京天坛的 弱项和不足：表达水平低，
抗原数量少，每剂疫苗只含5微克或 10微克的抗原，比华兰疫苗抗原含量 少一倍，所以抗体滴度低和抗体持续 时间较短。
北京天坛和新乡华兰表达 水平和抗原产量的比较
表达水平
北京天坛 新乡华兰 50微克 300微克
抗原产量
低 高
北京天坛和新乡华兰疫苗 抗原含量和抗体反应的比较
•甲基营养型酵母：以甲醇为唯一能源和
炭源的酵母。
1,多个HBsAg基因拷贝被整合到染色体中，遗
传稳定性好。 2,发酵过程中不产生乙醇，黏度小，可实现高 密度培养。
3, 高 效 表 达 HBsAg 400-1000mg/L 。 4, 发酵过程中均使用化学合成培养基，不 使用酵母粉等营养成分，生产成本低。 5，生物安全性好，汉逊酵母是存在于土壤， 水中的一种酵母种群。它不含人和动物的 病原体，不产生内毒素。按照国外基因技 术法规，汉逊酵母被列为基因操作生物安 全性1组。与酿酒酵母属同一生物安全等级。 国外生物安全委员会还将汉逊酵母选为典 型的工业菌株的研究模型。
国外主要的乙肝疫苗生产厂家
厂家 美国默克公司 Merck 比利时史克公司 Smith kline 法国巴斯德研究所 Pasteur Merieux 德国莱茵公司下属的 韩国绿十字疫苗公司 Green Cross 疫苗 重组酿酒酵母乙肝疫 苗 重组酿酒酵母乙肝疫 苗 重组CHO细胞乙肝疫 苗 重组汉逊酵母乙肝疫 苗
重组汉逊酵母乙肝疫苗 的特点：
三高
• 1，抗体阳转率高。 • 2，抗体滴度高。 • 3，母婴阻断率高。
用重组汉逊酵母表达产物—乙肝 表面抗原制备的重组汉逊酵母乙 肝疫苗是新一代的乙肝疫苗，它 在临床实验中有优秀的"三高”表 现，，即抗体阳转率高，抗体滴 度高，母婴阻断率高。
乙型肝炎病毒感染的预防： I，被动免疫：
的乙肝疫苗的基本情况： • 生产技术：从美国MERCK公司引进。 • 年产量：1000万人份，3000万支。 • 生产设备：从美国购进。
• 基本技术资料： • 菌种：重组酿酒酵母 • 表达水平：50mg/L • 表达效率：1,35%(表面抗原蛋白/酵
母总蛋白） • 纯化收率：20% • 发酵罐工作体积：500L • 一次发酵所得抗原量： 50mg/Lх500L=25g • 纯化后所得抗原量25gх20%=5g • 可生产疫苗量 5,000,000/5=1,000,000支
2，减毒活疫苗
• 患者---分离出致病微生物（细菌或者
病毒）-----通过改变培养条件，获得 不再致病微生物---培养不再致病微生 物，获得大量的不再致病微生物---铝 吸附-----减毒活疫苗。
乙肝病毒的体外培养至今没有成功
• 前面，我们已经讲过，细菌要在培养基中
繁殖，病毒要在细胞中繁殖，比如，流感 病毒在鸡胚细胞中生长，狂犬病毒要在地 鼠肾细胞中生生长，乙脑病毒要在vero细 胞中生长。可是乙肝病毒在所有实验过的 细胞中都不能生长。乙肝疫苗的研究受到 了严重的困难。人们不得不寻求其他的途 径去生产乙肝疫苗。
重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫小 学生抗体阳转率和抗体GMT
3个月 疫苗 批号 人数 7个月 12个月
抗体阳 抗体 转率% GMT
抗体阳 抗体 转率% GMT
抗体阳 抗体 转率% GMT
501 502 503
114 107 127
97,87 230,5 98,25 897,1 100,0 791,6 95,19 246,6 100,0 915,6 100,0 875,1 100,0 311,6 99,21 932,5 96,77 867,6
结论：
1，重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫小学生后 副反应轻微。 2，重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫小学生后 抗体阳转率和抗体水平较高。
重组汉逊酵母乙肝 疫苗的人体试验结果
B，母婴传播：
选择HBsAg,HBeAg双阳性母亲所生新生儿
45名，按 0，1，6免疫程序接种
10ug/0,5ml 重组汉逊酵母乙肝疫苗,采集第1 剂免疫后3，7月血样，并检测。同时，还免疫 了41名健康母亲所生的新生儿和5名 HBsAg 阳性,HBeAg阴性母亲所生的新生儿做比较。
• 4, 1971年Krugman发现加热处理
的急性期乙肝患者的血清能部分预 防乙肝感染。 • 5, 1981 年 Merck 公司在世界上首 次研制成功第一代乙肝疫苗 —— 血 源性乙肝疫苗。 • 6, 1985 年北京生物制品研究所在 国内首次研制成功血源性乙肝疫苗. • 7, 1986 年 Merck 公司在世界上首 次研制成功第二代乙肝疫苗 ----- 重 组酵母乙肝。