实验一
蛋白质的变性、凝固及沉淀
生物化学与分子生物学教研室
精品课件
实验目的
能够说出蛋白质变性、凝固反应的原理及实验方法 能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法 能够运用盐析法及重金属沉淀法
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主要实验内容
蛋白质的加热变性凝固 蛋白质沉淀反应
蛋白质盐析 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质
变性实质：
高浓度尿素、盐酸胍等
破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、
分子量不变）。
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变性的可逆性
可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可 以恢复原状。
不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构 不能恢复原状。
利的保存 保护体内蛋白质
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蛋白质的胶体性质及沉淀:
不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，可以通过 不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分段盐析。
大部分蛋白质都可用饱和(NH4)2SO4溶液盐析出来。 某些蛋白质在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出。 盐析是一个可逆沉淀反应。
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实验内容
① 取一只小玻璃试管，加入2mL蛋白质溶液；
② 加入等体积饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后静置3min。
观察现象（
）
③ 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中， 取部分转入另一只试管中；
④ 向一只试管中加入结晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不 再溶解（成为饱和(NH4)2SO4溶液）；
⑤ 比较两只试管现象（
）
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蛋白质沉淀反应
重金属盐沉淀蛋白质
在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶 性蛋白盐而沉淀。
1. 向1号管中加入：pH4.8缓冲液10d 。混匀，于酒精灯
上缓慢加热至沸点，观察变化（
）；
高温下，蛋白质发生不可逆的变性并凝固。
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2. 向2号管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L HCl 2d。混匀， 于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化
（
）
① 停止加热，向2号管中逐滴加入：0.1mol/L NaCO3 。 摇匀后继续滴加，一旦出现絮状物即停止。
实验内容
① 取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液； ② 加入0.1mol/mL NaOH 2d，混匀； ③ 逐滴加入CuSO4，摇匀，直至出现沉淀为止。
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蛋白质沉淀反应
生物碱试剂沉淀蛋白质
在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、 钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝 酸)结合成不溶性的盐沉淀，此时蛋白质带正电荷 易于与酸根负离子结合成盐。
）
⑥ 冷却后，再加入： 0.1mol/L NaOH 2d。观察现象
（
蛋白质）变性不一定出现沉淀；
蛋白质变性后在特定精条品件课件下发生沉淀，并可逆；
蛋白质沉淀反应
蛋白质的盐析
一定浓度中性盐 （ (NH4)2SO4、Na2SO4等）可去除 蛋白质分子所带电荷及其表面的水化层，从而使蛋 白质从溶液中聚集沉淀出来。利用这个原理使蛋白 质从溶液中沉淀出来的方法为盐析。
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蛋白质的变性 (denaturation)
在某些理化因素的作用下，蛋白质严格的空间结 构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性 质和生物学性质改变的现象。
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变性后的蛋白质称变性蛋白,能使蛋白质 变性的物质叫蛋白质变性剂。
高温、高压
物理因素
紫外线、X射线、
变性因素 化学因素
电离辐射和超声波等 强酸、强碱 有机溶剂、重金属盐
（
）；
① 停止加热，向3号管中逐滴加入：0.1mol/L HAC。一旦 出现絮状物即停止。
② 继续滴加：0.1mol/L HAC 1d。观察现象
（
）
③ 将3号管于酒精灯上加热，观察现象（
）
④ 向3号管中加入： 0.1mol/L NaOH 。一旦出现絮状物 即停止。
⑤ 将3号管于酒精灯上加热，观察现象（
脱水
脱水
++ +
+
+
+
+
+
带正电荷的蛋白质
（疏水胶体）
碱
酸
不稳定的蛋白质颗粒 （沉淀）
蛋白质胶精品体课颗件 粒的沉淀
-- -
-
-
-
-
-
带负电荷的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
-
-
---
带负电荷的蛋白质
（疏水胶体）
蛋白质的沉淀
可逆沉淀
结构和性质都不变 适当条件下可重新溶解 是分离和纯化的基本方法
不可逆沉淀
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蛋白质的加热变性凝固
蛋白质分子受热作用，分子空间结构变化，疏 水基团暴露于分子表面，溶解度降低。
当蛋白质分子不带电荷（处于等电点条件下）， 则蛋白质发生聚集出现沉淀；
当蛋白质分子带电（处于非等电点条件下）， 则蛋白质因静电排斥作用而不出现沉淀；
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实验内容
取三只小玻璃试管，各加入10%蛋白质溶液 10d，分别标记为1、2和3号管；
② 将2号管于酒精灯上加热，观察现象（
）
③ 冷却后，再加入： 0.1mol/L HCl 2d。观察现象
（
）
蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀；
沉淀加热后发生不可逆变性并凝固。
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3. 向3号管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L NaOH 2d。混匀， 于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化
实验内容
① 取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液；
② 加入饱和苦味酸 6d，观察现象（
）；
注意：苦味酸属危险试剂，操作时勿接触皮肤
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实验记录与实验报告
⑴ 实验目的； ⑵ 实验原理； ⑶ 仪器、材料和试剂； ⑷ 实验步骤； ⑸ 结果讨论（含数据处理）；
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结构和性质都发生变化 沉淀不再溶解于水
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蛋白质的凝固
蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为凝固。 不可逆变性状态
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蛋白质变性、沉淀与凝固的关系
变性属于蛋白质本质的变化，沉淀和凝固属于 一种现象
变性不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近 才沉淀
变性蛋白易于沉淀， 沉淀蛋白不一定变性 沉淀的变性蛋白质也不一定凝固
蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间,属胶 体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。
表面形成水化层 原因
表面同种电荷的斥力
+++
+
+
+
+
+
除去这两个因素，就会发生沉淀。蛋白 质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。
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++ +
酸
碱
+
+
+
+
+
碱
酸
带正电荷的蛋白质 （亲水胶体）
在等电点的蛋白质 （亲水胶体）