第十七章
分子生物 学常用技
术
分子生物学常用技术
凝胶电泳 分子杂交 聚合酶链反应(PCR)技术 DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片
第一节 凝胶电泳
(gel electrophoresis)
电泳概念 基本原理
Q μ＝
6πrη
μ: 迁移率 电荷量 r : 粒子半径（分子量） η: 度
答疑：1.10 (9:00-11:30; 3:00-5:30) 地点：逸夫楼3楼生化实验室
三、探针(probe)
探针的概念 探针的类型 标记物的种类 标记方法
1. 探针的概念
特异结合和检测靶分子的活性物质
–抗原－抗体 –配体－受体 –同源DNA/RNA
2. 探针的类型
1. 电荷效应
核酸是两性电解质
pH = 3.5 ,
正电荷
pH = 8.0~8.3 , 负电荷，正极
2.分子筛效应
小分子移动快 ，大分子移动慢
3. 分子构象
-
+
闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA
（二）操作要点
支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收
35ul/100ml
PAGE装置
电泳
4. 凝胶中DNA的检测
溴乙锭染色法 银盐染色法
Ag+－DNA
放射自显影法
Ag（黑褐甲色醛） 还原
5.DNA片段的回收
压碎浸泡法
– <1kb – 纯度高，回收率低
（三）PAGE优点
机械强度好、化学稳定性高 分辨率高 载样量大 回收的DNA纯度高
5. 样品制备
上样缓冲液
– 50%甘油/蔗糖 – 0.5%溴酚蓝/二甲苯
青
点样
6.电泳条件
潜水电泳 恒压电泳
– 低压: 1~2V/cm – 中压: 8~10V/cm – 高压电泳：>几十V/cm
温度：15~25℃
潜水电泳
7.电泳染色
溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理 染色方法
固相支持物的种类
硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter
membrane) 尼龙膜(nylon membrane)
1.硝酸纤维素滤膜
特点
– 吸附ssDNA和RNA – 杂交信号本底低
不足
– 不适于重复杂交 – 滤膜较脆 – 不适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(<200bp)结合能力弱
（四）PAGE应用范围
分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA DNA序列分析 PCR产物鉴定 蛋白质的检测和分析
第二节 分子杂交
分子杂交的基本原理 固相支持物 探针 几种常用杂交技术
一、分子杂交的基本原理
核酸的变性和复性
分 子 杂 交
DNA-DNA
DNA-RNA
–加入凝胶液中 –电泳结束后染色
EB染色原理
紫外灯下显色
8. DNA片段的回收
低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(>5kb) DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)
（三）应用围
DNA的分离、纯化和鉴定
– 限制性酶切图谱分析 – 重组体的分离、鉴定 – 杂交分析 – PCR产物的分离鉴定
试剂
制备浓度(%)
(ml) 3.5 5.0 8.0 12 20
30%Acr 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6
ddH2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5XTBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
10%AP 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
TEMED
杂交条件
靶分子 探针 杂交袋 杂交炉
杂交种类
被检核酸种类和方法
– 原位杂交 – 斑点杂交 – Southern杂交 – Northern杂交 – Western杂交
反应介质
– 液相杂交 – 固相杂交()
二、固相支持物
固相支持物的特性
–结合能力强 –不影响杂交反应 –结合牢固 –非特异性吸附少 –机械性能良好
2. 尼龙膜
特点
– 结合能力强 – 可反复杂交 – 韧性强 – 适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(10bp)结合能力强
不足
– 杂交信号本底较高
分子生物学考试
时间：2005.1.11(晚7:00-9:00) 地点
– 9教讲演厅 (150人) – 9-2-1 (50人) – 9-2-2 (50人) – 9-3-1 (50人)
琼脂糖凝胶电泳
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamide gel electrophoresis,
分离原理
PAGE)
操作要点
优点
应用范围
（一）分离原理
电荷效应 分子筛效应
PAGE支持物
单体－丙烯酰胺(Acr) 交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂－过硫酸胺(AP) 加速剂－N,N,N’,N’-四甲基乙二
胺(TEMED)
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶
（二）操作要点
凝胶的分类 凝胶浓度的选择 凝胶液的配制 凝胶中DNA的检测 DNA片段的回收
1. 凝胶的分类
非变性凝胶：dsDNA 变性凝胶: ssDNA
–尿素 –甲酰胺 –SDS
2. 凝胶浓度的选择
3. 凝胶液的配制
Q: 介质粘
电泳的用途
–分离 –鉴定纯度 –测定分子量
凝胶电泳的种类
–琼脂糖凝胶电泳 –聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、琼脂糖凝胶电泳
(agarose gel electrophoresis)
分离核酸原理 操作要点 应用范围
（一）分离核酸原理
电荷效应 分子筛效应 分子构象
1. 支持物
商品化的琼脂糖
琼脂糖种类
普通 低熔点 高纯 高筛分
熔点 80~90℃ <70℃ 80~90℃ 80~90℃
机械强度 中
差
高
高
分辨率 中
差
中
高
2. 凝胶浓度的选择
凝胶的制备
3. DNA marker
DNA marker
DNA 长度标准曲线
4. 电泳缓冲液
Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(TPE) pH 8.0
基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 蛋白质或多肽探针