生化项目的基本分析方法
1．终点法检测
1.1定义
完全被转化成产物，不再进行反应达到终点，取反应终点的吸光度来计算被测物质的浓度。

生化检验中除酶和BUN、CRE外几乎都用终点法来进行检测。

被测物质（反应底物）在化学反应过程中完全被消耗或转换，即反应达到平衡（终点），通
过测定产物（反应生成物）的多少来定量测定被测底物的含量。

终点法一般用来检测代谢物
的浓度，通过测定标准液（校准液）的反应吸光度，建立一条浓度与吸光度变化的标准曲线。

通过检测标本的吸光度与标准液的吸光度进行比较，计算出该标本中待测物的浓度。

1.2检测流程
一点终点法：取反应达终点时的一个点的吸光度来计算结果。

对于单一试剂，在加入标本后，反应即可进行，在反应达到终点后，读取反应点（吸光度），故一般选用一点终点法。

以试剂和样品混合之前的空气空白(GB)、水空白(WB)或试剂空白(RB)的吸光度值为测定计算基点，以反应终点的吸光度读数减去空白读数，得到反应吸光度。

通过与相同条件下校准液
反应吸光度的比较，求得测定结果。

常与一点校准法配合使用，即采用一个校准浓度，校准
曲线通过零点且成线性。

也应用多点校准。

•计算公式：
C=(Am-Ab)*K
Am----终点读数点的吸光度
Ab----试剂空白吸光度
K----校正系数
二点终点法：加入第一试剂，主要起缓冲或者消除干扰等作用，此时可读取初始反应点，加入第二试剂后，在反应达到终点后，读取结束反应点。

取反应尚未开始时读取一个点的吸光度，待反应达终点时再取第二点的吸光度，用第二点吸光度减去第一点吸光度的差值来计算结果。

以试剂和样品混合之后的某一时间点作为始点，以反应终点的吸光度读数减去始点读数。

一定条件下可降低样品对反应或反应本身的特异性于扰(主要指色度干扰)。

常采用双试剂，多以加R2前某一点作测定始点；某些情况下，也可以加R2后一点作测定始点。

若使用单试剂，主反应启动太快或仪器起始读数点受限时难以运用。

主要用于扣除试剂和样品空白，保证结果的准确性，一般双试剂用。

•计算公式：
C=(An-K0*Am)*K
K0---体积校正因子
K0=(Sv+R1)/(Sv+R1+R2)
1.3项目举例
常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高
密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。

以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它
测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。

2．固定时间法（两点法）
2.1定义
是取尚在反应中的两点间的差值来计算结果，此两点既不是反应起始点也不是终点。

在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，这两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，利用这两点吸
光度差值计算结果。

3.2检测流程
将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，
通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（－d[S]/min）或产物生成速度（d[P]/min），将速度换算为mol/min便是以国际单位表示的
酶活性。

•计算公式：
C=(A2-A1)*K
3.3项目举例
主要用于检测一些非特异性的项目，如肌酐。

3．连续监测法（动力学法、速率法）
3.1定义
是在测定酶的活性或酶代谢产物时，连续取反应曲线中呈线性变化吸光度值（△；A/min）来计算结果。

因在反应线
性时间内各点间的吸光度差值为零故又称谓零级反应。

在可见光区(GGT、ALP：405nm黄色)或紫外（HBDH 、LDH、ALT： 340nm）在一段时间内连续监测某一物质的生成 (或消耗的) 速率，计算待测物的活性，一般用于样本中酶活性的检测。

3.2检测流程
3.2.1连续监测法零级反应速率法，亦称斜率法。

将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率，求出酶活性浓度。

在较长的反应时间区段内(至少90-120秒)，每隔一定时间(常为2~30秒)读取一次吸光度值，至少读取4点，得到3个△A；一般将连续多次读数作最小二乘法处理，读数间隔时间太短
的作带速率时间(TR)多点法处理，均取线性反应部分的读数，求出单位时间内的反应速率
△A/min。

此法必须以零级反应为测定计算的基础，因为只有在零级反应下，单位时间内的
吸光度变化(反应速率△A/min)才与酶活力呈正比。

此法相对减少了分析误差，大大提高了分析速度和准确性。

应用连续监测法，首先应准备线性范围内的高、中、低浓度的样品，分别作反应时间进程曲线，了解不同浓度下反应全过程，兼顾确定延迟时间和线性监测期。

3.2.2两点速率法即所谓拟一级速率法。

在反应中选取两时问点t 1、t 2，读取吸光度A 1、
A2，计算(A2-A1)，(t2-t1)=△A，△t。

此方法与终点两点法的区别主要有两点：后一读数点反应未达终点，以速率计算结果。

它与连续监测法比较，缺点在于人为确定t 1、t 2，不定因素较多，不能保证反应在t 1-t 2期间呈线性，影响结果准确性；应在常规测定前，先做预试验来确定线性时间段。

若在选择的时间段内反应不成线性(如零级反应期短，仪器无法设置或
测定)，则只能改用终点法。

优点在于方法简单；酶活力较低、测定吸光度值较小时，可增加测定时间段而不受仪器连续监测时间点的局限，减少读数误差。

3.2.3速率B法在一个通道内一次进行两项反应相关的速率法测定。

它既可以是两项试验测定，也可用于干扰或／及样品空白自动补偿0后一用途的原理是：利用仪器的微机自动处理，在第一反应(干扰反应)一直维持线性的前提下，可以从第二反应(主反应)速率中扣除第一反应速率的延续影响。

如用于消除胆红素转化为胆绿素吸光度下降、对肌酐苦味酸法测定的负干
扰等。

某些仪器(如HITACHI系列)设置此方法。

3.2项目举例
对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸
脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。

一些代谢物酶法测定的
项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。

4．透射比浊法
4.1定义
是测定入射光强度由于溶液中粒子的散射而降低的程度，它并不直接测定散射的光强。

通
过物质对光的散射或透射来测定物质含量的，通常作两点终点法分析，多采用多点校准。

散射比浊：特定蛋白分析仪
透射比浊：自动生化分析仪
4.2检测流程
样本和试剂反应时，纤维蛋白原转化为纤维蛋白，光通过该反应介质，从而发生光散射。

660nm光通过血浆，并在900角配备光传感器进行检测光信号。

4.3项目举例
透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、
补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白
等均可用此法。

用Ab测定Ag（主要为微量蛋白：IG、C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab过量，此时Ag-Ab复合物的生成量随Ag的增加而递增，光散/透射射强度与抗原量
成正比。

*同一个项目，不同检测方法。

甘油三酯
GPO-PAP法为临床实验室测定血清TG的常规方法，反应原理如下：血清中TG在LPL作用下，水解为甘油和FFA，甘油在ATP和甘油激酶（GK）的作用下，生成3-磷酸甘油，再经磷酸甘油氧化酶（glycerophosphate oxidase，GPO）作用氧化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢（H2O2），H2O2与4-氨基安替比林（4-AAP）及4-氯酚在过氧化物酶（POD）作用下，生成红色醌类化合物，其显色程度与TG的浓度成正比。

采用两步双试剂法去除FG的影响。

将 LPL 和 4-AAP 组成试剂2，其余部分为试剂1.血清先加试剂1 ，37℃孵育后，因无LPL 存在，TG不被水解，FG在GK和GPO的作用下反应生成H2O2 ，但因不含4-AAP，不能完成显色反应，故可除去FG的干扰；再加入试剂2，即可测出TG水解生成甘油。

总胆固醇。