纯合型家族性高胆固醇血症家系基因型与表型分析（全文）家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia，FH）是一种常染色体显性遗传病，致病基因主要包括编码低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）、载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）、前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin kexin-9，PCSK9）和低密度脂蛋白受体衔接蛋白1（low density lipoprotein receptor adaptor protein 1，LDLRAP1）基因，其中LDLR 基因突变最为常见[1,2,3]。
根据基因型FH分为杂合型（heterozygous familial hyperlipidemia，HeFH）和纯合型（homozygous familial hyperlipidemia，HoFH），HoFH患病率约为1/（16万~100万），未经治疗青少年期即可发生冠状动脉粥样硬化性心脏病，甚至猝死[4]，属于严重的罕见病，2018年被列入国家第一批罕见病目录。
本研究对2018年10月于西安市儿童医院确诊的1例LDLR-E140K基因纯合突变的HoFH患儿及其家系进行遗传学及基因型与表型分析。
对象和方法一、对象前瞻性研究。
选择西安市儿童医院心内科2018年10月确诊的HoFH 先证者及其家系共20人为研究对象，本研究经西安市儿童医院伦理委员会批准同意（20190023），研究成员均签署了知情同意书，14岁以下由家长签署知情同意书。
HoFH诊断标准依据2014年欧洲动脉粥样硬化协会（European Association of Atherosclerosis，EAS）HoFH管理指南，基因诊断标准[5]：LDLR、ApoB、PCSK9和LDLRAP1基因检测到明确的2个突变位点；临床诊断标准：治疗前低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）＞13 mmol/L或治疗后LDL-C＞8 mmol/L，并且10岁之前出现皮肤或肌腱黄色瘤或父母LDL-C水平与HeFH一致。
二、方法1．临床资料：收集病史、体格检查、心肌酶、肝肾功能、心电图、超声心动图，血脂测定包括总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）、LDL-C、甘油三酯（triglyceride，TG）、载脂蛋白A1（apolipoprotein A1，ApoA1）、载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）。
2．基因组DNA提取和基因突变分析：采集先证者及家系成员外周血各3 ml，用外周血基因组DNA提取试剂盒（北京天根）提取基因组DNA。
将先证者的基因组DNA送至北京信诺百世医学检验所进行全外显子组的靶向捕获二代测序，采用生物信息分析软件sortingintolerant from tolerant（SIFT）、polymorphism phenotyping V2（PolyPhen2）及Mutation_Taster进行变异致病性预测分析，依据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）于2015年发布的"序列变异解读标准和指南"评估变异的致病性[6]。
对二代测序所分析出的候选基因突变位点在家系内进行Sanger测序验证，300名汉族正常人为对照。
对发现的变异进行家系成员基因型表型分析。
三、统计学处理采用SPSS 13. 0统计学软件进行数据处理，正态分布的计量资料采用±s表示，组间数据比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果一、临床特点先证者男，7岁10月龄，因"生后尾骨处皮肤黄色突起，双侧肘关节、膝关节、踝关节皮肤多个黄色瘤样结节4年"于2018年8月就诊于西安市儿童医院心内科门诊。
患儿生后尾骨处皮肤可见圆形绿豆大小黄色皮肤突起，3~4岁时原有皮肤突起较前变大，双侧肘关节、膝关节伸侧面及双侧跟腱处皮肤亦逐渐出现直径0.5~1.5 cm的黄色瘤样结节（图1A），随年龄增长不断增大、增多，当地医院皮肤科诊断"黄瘤病"，先后3次对肘关节、膝关节及指间关节处黄色瘤给予激光清除，病理检查提示黄瘤病，术后局部瘢痕形成，随后长出新的黄色瘤。
多次血脂检查示总胆固醇18.16~21.24 mmol/L，LDL-C 14.08~15.51 mmol/L，患儿身高、体重、及智力发育与同龄儿相同。
父母为近亲婚配，患儿父亲外祖父（Ⅱ-5）和患儿母亲祖父（Ⅱ-9）为同胞兄弟，家系图见图2。
家族其他成员无类似皮肤黄瘤。
图1 家族性高胆固醇血症患儿临床特征和超声学检测结果A：大体图示双侧膝关节多发黄色瘤；B：颈总动脉超声示动脉内膜增厚和粥样硬化斑块（箭头）；C：超声心动图示主动脉瓣关闭不全舒张期血液反流（箭头）；D：超声心动图示主动脉瓣增厚及回声增强钙化斑（箭头）图2 家族性高胆固醇血症家系图体格检查：体温36.5 ℃，呼吸20次/min，脉搏98次/min，血压96/62 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），体重28 kg。
发育正常，营养中等，双眼眼球活动自如，结膜、巩膜正常，角膜透明。
胸部对称无畸形，双肺呼吸音稍粗，未闻及干湿啰音。
心前区无隆起，心尖搏动正常，心前区无震颤，无心包摩擦感，叩诊心界正常，心律齐，心音有力，各瓣膜区未闻及明显杂音。
腹平软，肝、脾肋下未及。
脊柱四肢无畸形，双侧肘部、双侧膝关节、双侧踝关节、骶尾部可见多发结节状黄色瘤及激光术后疤痕，无压痛，各关节活动自如；神经系统检测无异常。
实验室及辅助检查：肝肾功能、心肌酶、心电图均未见异常。
颈部超声提示双侧颈动脉及椎动脉弥漫性硬化斑块（图1B），心脏超声心动图提示主动脉瓣增厚、钙化伴少量反流（图1C、图1D）；冠状动脉未见明显粥样斑块。
眼底检查正常。
二、家系基因突变分析高通量测序示先证者携带LDLR基因第4外显子c.418G＞A纯合突变（图3A），导致LDLR第140位谷氨酸被赖氨酸替代（p. E140K），命名为LDLR-E140K，纯合突变分别来自患儿父母，二人携带相同的LDLR 基因c.418G＞A杂合突变（图3B、图3C）。
LDLR-E140K为人类基因突变数据库（human gene mutation database，HGMD）收录的高胆固醇血症患者中检出的已知突变。
该突变未在千人数据库中收录，人类外显子组整合数据库（Exome Aggregation Consortium，ExAC）记录其频率为0.000 02。
生物信息分析软件SIFT、PolyPhen2及Mutation_Taster均预测该变异有害，依据ACMG于2015年发布的"序列变异解读标准和指南"评估为致病性变异[6]。
家系中Ⅲ-15、Ⅳ-17、Ⅳ-18携带LDLR-E140K基因杂合突变。
注：NCBI为美国国立生物技术信息中心；箭头所示为突变位点图3 家族性高胆固醇血症先证者全外显子高通量测序及父母验证结果A：先证者LDLR基因存在c.418G＞A（p.E140K）纯合突变；B：先证者之父（Ⅳ-5）Sanger验证结果示LDLR基因存在c.418G＞A （p.E140K）杂合突变；C：先证者之母（Ⅳ-14）Sanger验证结果示LDLR基因存在c.418G＞A（p.E140K）杂合突变三、基因型与表型分析家系基因型和血脂检测总结见表1。
根据2014年EAS的HoFH诊断标准，先证者携带LDLR-E140K基因纯合突变，治疗前LDL-C＞13 mmol/L，并且10岁之前出现皮肤及跟腱黄色瘤。
故基因和临床均符合HoFH诊断，由于2个等位基因为相同变异，故为真HoFH。
患儿父母及家系中患儿外祖父Ⅲ-15、患儿舅父Ⅳ-17、Ⅳ-19携带LDLR-E140K基因杂合突变，且均LDL-C＜13 mmol/L，故基因和临床诊断为HeFH。
先证者HoFH临床表型重，确诊时已经出现心血管损伤，颈动脉、升主动脉内膜增厚及粥样硬化，主动脉瓣增厚及钙化，并出现主动脉关闭不全表现。
治疗上给予低脂饮食、体育锻炼生活指导，考虑患儿已经出现早期心血管病变，给予双重滤过胆固醇血浆置换联合口服普伐他汀钠药物治疗，血浆置换术每2~3周1次，已治疗10个月，患儿病情平稳。
患儿父亲出现角膜环，双侧颈动脉硬化并斑块形成，家系中其他HeFH患者尚未发现动脉粥样硬化以及冠状动脉粥样硬化性心脏病表型。
HeFH与未携带突变家系成员血脂参数比较，HeFH患者总胆固醇、LDL-C和ApoB明显高于未携带突变成员（野生型）（P均＜0.05，表2）。
讨论LDLR基因突变是FH最为常见的致病基因，目前已经确定1 000多个突变位点，包括错义突变、移码突变、缺失突变等[7,8,9]。
本研究家系的先证者父母为近亲结婚，且均携带相同杂合LDLR-E140K基因突变，临床及基因诊断均符合HeFH，先证者携带纯合LDLR-E140K基因突变，多次检查LDL-C＞13 mmol/L，且出生时即有皮肤黄瘤病，3~4岁大关节区开始出现黄色瘤，临床及基因诊断符合HoFH，且基因型为真HoFH。
家系中除了先证者为HoFH外，发现5个成员为HeFH，所有HeFH 家系成员LDL-C均升高，患儿父亲出现角膜环和主动脉内膜增厚，其他HeFH尚未发现心血管病变。
未携带LDLR-E140K基因突变的家系成员，总胆固醇、LDL-C、ApoB均正常，基因型表型分析确定LDLR-E140K基因突变在本家系中存在共分离现象，为致病性变异。
LDLR-E140K基因突变在HGMD数据库和ClinVar均有报道（https：///clinvar/variation/251213），但都是在FH队列研究的基因筛查中发现，共15例，未进行家系研究，本研究家系中先证者的纯合LDLR-E140K基因突变经过权威机构查新为首次发现。
由于HoFH患儿从出生起就暴露在高水平的LDL-C环境中，动脉粥样硬化疾病的发生发展从出生即开始[2,10]。
儿童HoFH属于严重的罕见病，表型的严重程度取决于残留的LDLR活性，活性越低表型越严重。
已有功能研究表明，LDLR-E140K基因突变导致LDLR活性减低。
Rubinsztein等[11]通过分子克隆实验证实LDLR-E140K基因突变可导致MnlⅠ酶切位点消失，Webb等[12]通过体外功能实验证实该变异降低LDLR的活性。