2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活
CRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ ＤＮＡ配对 利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特 CRISPR－on系统。 真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子 ＶＰ16结合获得。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理
CRIPSR 基因座的表达 (包括转录和转录后的成熟 加工) 当该噬菌体再次入侵细 菌时，CRISPR 簇首先转录 为长的crRNA前体，然后逐 步被加工成小的成熟的 crRNA。 CRISPR/Cas 系统活性的 发挥或者是对外源遗传物 质的干扰 crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互 补配对精确地与目标DNA相 结合，随后Cas 蛋白对目 标DNA 进行断裂和降解。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理
2、CRISPR-Cas系统的应用
2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑 技术
基因组编辑技术是一种可以在基因组 水平上对DNA序列进行改造的遗传操 作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切 酶，在预定的基因组位置切断DNA， 切断的DNA在被细胞内的DNA修复 系统修复过程中会产生突变，从而达 到定点改造基因组的目的。 通过修复途径，基因组编辑技术可以 实现三种基因组改造，即基因敲除， 特异突变的引入和定点转基因 基因组编辑是研究基因功能的重要手 段之一，也可被用于人类遗传性疾病 的治疗，因此这类技术成为现代分子 生物学的研究热点
例子：基因敲除的实验过程
1、在把基因序列中寻 找NGG序列获得其附近 20多个碱基的序列， 与tracrRNA序列融合， 设计出sgRNA并合成该 序列。 2、将该序列以及cas9 基因连入如图所示载 体。 3、转化感受态，质粒 小提，测序验证。 4、细胞培养与细胞转 染 5、敲除效果检测。 6、建立稳定敲除的细 胞株
CRISPR/Cas9系统及 其应用
CRISPR-Cas系统简介
CRISPR-Cas系统的应用技术
CRISPR-Cas系统的应用前景
1. CRISPR-Cas系统简介
1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中， 2002 年， 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质 高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的 RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。
1.2CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排 列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它 与folk酶功能类似，但是它并不需要形 成二聚体才能发挥作用。
2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入 侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转 移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能
2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞 EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。同 年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成 双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定 点插入。
3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景
3.1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因
为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要 替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不
具特异性。 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单
方便。
较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来 的并发症。
3.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景 目前应用CRISPR-Cas9系统的研究主要集中在基因编辑方 面。而Cas9真正的优势主要在于它具有能够将３种主要生 物聚合物（ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质）结合在一起的特殊 能力。 各种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，然后利用 gRNA的靶向作用结合到dsＤＮＡ的任意位点，发挥人们预 期的功能。 例如：Cas9如果与甲基化酶或去甲基化酶、乙酰化酶或去 乙酰化酶、激酶、磷酸化酶等促进染色质结构变异的蛋白 成功融合还将有助于表观遗传学的研究，并能够持久改变 基因的表达状态。如果几个作用于基因组不同位点Cas9复 合物的协同作用，还可通过改变基因组的结构实现基因调 控的目的。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理 CRISPR 的高度可变的间隔区的获得
首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（NGG序列），将临 近 PAM 的序列作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5'端 合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间
2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活
在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系统中将Cas9中的切割域突变，会使Cas9蛋白 失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ 结合的能力。这种失 去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名为Dead Ｃas9。将ｄCas9与 gRNA在细胞中共表达，则gRNA可以介导ｄCas9蛋白与ＤＮＡ 结合。 如果ｄCas9结合到靶基因的阅读框内，可阻断RNA聚合酶的延伸作用； 如果ｄCas9结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始
2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术
CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 Mali 等人 利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR 相关蛋白 Cas9，在一段人为重组的sgRNA( small-guide RNA) 的引导下，针对 小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编 程RNA 进行DNA 改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。