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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
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DNA
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第二章 基因工பைடு நூலகம்基本技术原理-DNA序列测定
待测 DNA 与 pBR322 或 pUC 分子
重组；
转化：转化反应物涂布在补加
有Xgal-IPTG选择性培养基平板上， 经37℃过夜培养；
挑选白色菌落，制备质粒NA。 碱变性处理，与引物一起退火，
然后按双脱氧法作序列分析。 优点：无需将 DNA 克隆到 M13 载 体上，更为简单快速，现已被许 多研究工作者采用。
克服缺点的一种途径—DNA分子克隆
将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载 体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为 载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。
引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体 DNA 中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分 子上与克隆位点相连的单链 DNA区段杂交。称做“通用引物” 。
反应体系中加入lmol/L浓度的盐，肼 同T的反应速率便会逐渐下降，以确 保发生C特异的化学切割反应。根据 这一特点区别C和C+T之间的降解产 物。
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
碱基特异的化学切割反应——硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］
在硫酸二甲酯的作用下，碱基环 中的氮原子发生甲基化反应（G N7和A N3）。 中性PH：甲基化导致配糖键水解， 留下失去碱基的糖一磷酸骨架上 的键。这种键十分微弱，易于使 糖片段两翼的磷酸脱落，造成 DNA断裂; 碱性 pH：采用六氢吡啶同DNA甲 基化反应，而这种反应对甲基化 的G是特异的。因此，DNA链的 断裂只在G发生。
3、Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理是什么 4、DNA杂交测序原理是什么 5、什么是寡核苷酸矩阵芯片 6、杂交测序有什么应用
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仍被采用。
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.2.1 Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理
化学试剂处理末端标记DNA片段，碱基的特异性切割产生的 DNA片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA 片段的核苷酸顺序。
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2.5.3 序列分析的自动化
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基因工程 2.5.4 DNA杂交测序
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
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基因工程 杂交的检测
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
这种方法特称为利用双链质粒 DNA模板的双脱氧 DNA
序列分析法。由于通常使用的质粒多是 pUC 载体系列， 所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列 分析法。
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法基本步骤
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基因工程 M13载体克隆DNA片段
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
将DNA片段克隆在M13mp载体特定LacZ区段中 重组体噬菌体在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白
色的噬菌斑;
非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。 从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链 DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。
基因工程 酶、原料比例
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
dNTP／ddNTP=100：1时，谱带分离效果较佳，可读出多
于 200个以上的核苷酸顺序。
降低dNTP对ddNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配 合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到 能判读出300个左右的核苷酸顺序。
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1.2 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法
引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷
高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制 策分 得析 高： 分这 子样 量处 理 后 吗， ？能
片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳
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基因工程 杂交测序的应用
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
检测单碱基的变化 序列比较分析 基因的表达状况 验证其他测序
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题
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基因工程 引物—延伸测序策略
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．Ray Wu
） 独创性地设计出一种崭新的引物延伸测序策略，并于 1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列；
1977，F.Sanger 在该策略的基础上，发展出了快速测定
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1 Sanger双脱氧链终止法
DNA核酸序列分析历程
60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和 研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实
第一，如何分离寡核苷酸片段；
另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。
分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。 为了将这些降解的 DNA片段，按其原来的顺序“拼排” 起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对 同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。
DNA
费时、费力、费钱、DNA损伤严重
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
你作对了吗？
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2.5.2.3 Maxam－Gilbert化学修饰法优点
不需要体外酶催合成反应 单双链都可以 需要末端标记 两端采用不同的标记，测序可从两端进行
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
运作方式 存在的问题
大公司“垄断”
仪器公司“垄断”
发展趋势
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SS S S
S S S S S S S SS SS
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“测序”思考回答问题 1、Sanger双脱氧链终止法原理是什么
2、使用M13mp载体系列的优点有哪些
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.2.2 化学修饰法测序图解
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试试看
C T+C G+A A
A
G+A T+C
C
T T A T C A G G A T
G G C G A C T T C G
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第五节 DNA核酸序列分析
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 ■ 2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法■
2.5.3 序列分析自动化■
2.5.4 杂交测序■ 2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题■ 2.5.6 思考问题■
使用M13载体系列的优点 所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样， 就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。 应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种 最普遍采用的快速的DNA序列分析法。
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1.3 Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法 将待测 DNA 片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形 的双链质粒 DNA按双脱氧链终止法作 DNA序列分析。
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
反应：同时加入引物和 模板、 DNA聚合酶 1、一 种 ddNTP、 以 及 四 种 dNTP（有一种带放射性 标记）。 变性胶电泳分离反应混 合物。 放射自显影术，检测单 链 DNA 片段的放射性带。 结果判读，从放射性 X 光底片上，直接读出 DNA的核酸顺序。
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法 是 1977 年由美国哈佛大学的 A．M．Maxam 和 W．
Gilbert 发明的，所以又叫做Maxam－Gilbert DNA
序列分析法 虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言， 化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度 也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中