蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法；2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。
实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹法。
蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。
试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中；3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20；5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。
6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。
高压灭菌20 分钟，室温保存。
用前稀释至1x 。
7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。
器材电泳装置一套;2.电转移膜装置3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。
2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。
在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。
3．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号（2）。
4．按下图示制备“夹心饼”，打开电极板，在一边放上一块纤维垫，再依次往上叠加3-4张滤纸，将凝胶轻放于滤纸上。
再将一张NC膜放上，加上3-4张滤纸，每加上一种物品都要精确对齐，并确保没有气泡。
再铺上纤维垫，最后将电极板夹上，夹上夹子插进转膜槽中。
5．按下示意图，接上电源（凝胶一边接负极，尼龙膜一边接正极），恒流电泳小时，/cm2 膜。
6．关闭电源，将尼龙膜取出，置塑料盒中用丽春红S染色约5分钟，回收丽春红S，然后用蒸馏水洗去背景染料显色，室温稍干燥后用铅笔描下Marker 所在位置，然后用PBST浸泡几次，完全洗去丽春红S染料（4）。
〈二〉封闭7．将膜放入塑料盒中，加入20mL 封闭液，置脱色摇床中缓慢摇动，室温1小时或4℃封闭过夜（5）。
〈三〉靶蛋白与第一抗体结合8 弃去封闭液，加入含有第一抗体的封闭液5～10mL，室温平缓摇动温育3小时。
然后尽量回收抗体溶液，- 20℃保存，可重复使用（6）。
9．用PBST室温洗膜3次，每次10 min（7）。
〈四〉与第二抗体反应10.弃去PBST溶液，加入适量（～5-10mL）含有第二抗体的封闭液，室温下平缓摇动温育1小时（8），尽量回收第二抗体。
11．用PBST溶液漂洗尼龙膜3次，每次10钟。
〈五〉显色12．把尼龙膜置于稀释50倍的DAB 溶液中，轻轻摇动，显色约10－30 min，待蛋白带的颜色深度达到要求后，用水漂洗，最后转移至PBS溶液中，拍照或扫描（9）。
注意事项与提示（1）电泳时间要根据目标蛋白大小而定。
（2）为避免干燥，可在胶上滴转膜缓冲液或浸泡在转膜缓冲液中，使其离子强度和pH值与转膜缓冲液一致。
（3）可用一圆棒在滤纸上来回滚动以驱除气泡。
（4）染色后整张膜呈红色，由于丽春红S与膜上蛋白的结合很不紧密，因此脱背景色时要注意观察，勿将红色的蛋白带也洗去；脱色完毕，观察转移效果，并用铅笔在分子量标准带处做上记号。
如果用预染的Marker，则不需要用丽春红染色。
（5）封闭液的作用是封闭膜上没有蛋白带的部位，以减少抗体的非特异结合；我们推荐4℃封闭过夜。
（6）抗体的用量以浸没尼龙膜为准，用封闭液稀释第一抗体，抗体的稀释度要由预实验来定，下列数值可作为参考：多克隆抗体：1：100到1：5000 小鼠腹水：1：1000到1：10 000（7）PBS对膜上的蛋白没有影响，但可洗去剩余的封闭液和其它杂质；Tween 20 是一种非离子型去污剂，含适当浓度Tween 20的PBST可洗去非特异结合的抗体，使整张膜的背景更清晰。
（8）一般所用的第二抗体（抗免疫球蛋白或蛋白质A）为酶标抗体，如辣根过氧化物酶标抗体或碱性磷酸酶标抗体。
第二抗体的稀释度一般为：1：200到1：2000。
本实验中第一抗体为鼠源单克隆抗体，因此二抗应选择兔抗鼠抗体，若一抗为兔源多克隆抗体，二抗应选择羊抗兔抗体。
（9）DAB有致突变之嫌，因此要戴手套操作；辣根过氧化物酶显色的条带在阳光下几个小时就会褪色，因此要尽快拍照。
实验安排试剂配制－电泳－转移：1天；杂交－显色－结果处理：约1天。
实验报告要求与思考题1．用数码相机拍下丽春红S染色和最后抗体显色的结果，计算目标蛋白的分子量，并对结果加以分析。
2．对实验中出现的其它问题进行分析讨论。
3．进行凝胶电泳时应如何选择样品点样，设置对照？篇二：3蛋白印迹技术《分子生物学实验》实验报告实验名称：蛋白印迹技术姓名：陈杰学号：3140104666序号：25 同组同学：唐陈曦带教教师：刘伟俞萍实验日期：2015年9月29日目录1.原理............................................................... ..................................................................... . (3)印迹技术............................................................... (3)RT-PCR ...................................................... .. (4)聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE）.......................................... (5)2.操作步骤............................................................... .. (5)安装垂直板型电泳装置............................................................... (5)凝胶的制备............................................................... .. (5)转膜............................................................... .. (6)封闭............................................................... .. (6)一抗反应............................................................... (6)洗涤............................................................... (7)二抗反应............................................................... (7)洗膜............................................................... .. (7)检测............................................................... .. (7)3.实验结果............................................................... .. (8)照片记录............................................................... .. (8)数据处理............................................................... (8)4.讨论............................................................... ....................................................................... 101.原理Westen印迹技术蛋白质印迹技术又称免疫印迹技术和Western印迹技术，是鉴别蛋白质的分子杂交技术。
Western blotting的原理是将经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。
且能保持电泳分离的蛋白质的相对位置不变（转膜装置和预染的标准相对分子质量蛋白的转膜结果见图8-2-5～5-2-7）。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的未标记的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应，经过底物显色、化学发光或放射自显影，可以检测电泳分离的某种特定蛋白成分的存在和含量。
该技术也广泛应用于检测某种蛋白的表达水平。
Western blotting实验过程主要有以下几个步骤：1、SDS-PAGE分离待检测的蛋白质；2、转膜：将SDS-PAGE分离的蛋白质转移到膜上；3、封闭：即利用非反应活性物质封闭固相载体膜上未吸附结合蛋白质的区域；4、抗体结合：即利用相应蛋白质的抗体（一抗）与待测蛋白质进行免疫结合，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应；5、底物显色或放射自显影检测电泳分离的特异性目的蛋白的存在与否和含量。
Western blotting的转膜方式以电转移最为常用，固相载体主要有：硝酸纤维素薄膜、尼龙膜和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。
硝酸纤维素薄膜结合蛋白的能力为100ug／cm2，综合性能较好，以往使用的人较多；尼龙膜结合蛋白质的能力较强，有很高的灵敏度，但结合背景较高；PVDF-膜具有较好的结合蛋白质的能力（200ug/cm2），且能较牢固地结合蛋白质，该膜的机械性能和化学特性强，不易卷曲或撕裂，在90%甲醇的脱色条件下也不会影响膜的结构，结合在膜上的蛋门质可以直接进行序列分析，具有较好的染色和检测的兼容性。