酶联免疫吸附测定蛋白浓度
作者姓名
（北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083）
[摘要]酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ElISA）是目前常用的免疫学检测方法之一，它不仅可以检测抗体，还可以检测抗原。
具有敏感性高、特异性强、方法简便、容易观察结果、便于大规模检测的特点，应用范围和程度可与放射免疫分析法相比拟。
本实验研究酶联免疫吸附的测量准确度及线性，实验过程中应注意的问题及ELISA技术的应用实例及研究进展。
[关键词] 酶联免疫吸附；HRP；分光光度法
酶联免疫吸附测定指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。
基本原理是首先使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
然后使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
最后利用酶促反应产生的荧光产物测定吸光度值。
利用洗涤的方法，固相载体上形成的抗原抗体复合物与初始加入的包被物浓度或者抗原抗体特异性有关，故最后结合在固相载体上的酶量与样品浓度成一定的比例。
故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/mL。
常见的ELISA方法有直接法，间接法，双抗夹心法，竞争法等，分别用于不同应用情形及检测需要。
80年代后，随着生物素-亲合素系统（BAS）作用被发现，这一亲和作用被结合应用到ELISA技术上，大大提高了后者反应的灵敏性与专一性。
同时，ELISA技术的研究进展还包括对灵敏度的提高。
碱性礴酸酶(AP)一双底物系统并不直接催化有色物质生成，而是使NADP 脱磷酸，生成NAD，NAD进入由醇脱氢酶和黄递酶催化的氧化还原循环，导致深色物质生成。
辣根过氧化物酶(HRP)一增强发光显示系统也在原先的方法上有所改进，用纳米金作为底物可使方法灵敏度高上百倍。
ELISA技术在医学中有广泛的应用，如肿瘤学，细菌学，病毒学的检测，在机理研究方面，免疫病理学，内分泌学，血液学的研究中都会用到ELISA技术检测特定分子的存在及含量差别。
1 材料和方法
1.1 材料
鼠抗氯霉素（CAP）单克隆抗体。
氯霉素-牛血清交联蛋白。
牛奶样品。
HRP-羊抗鼠Ig。
包被液：0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液（Na2CO3 0.159 克，NaHCO3 0.294克，蒸馏水稀释至100 mL）。
洗涤及稀释液：0.01mol/L pH7.4 PBST 溶液（NaCl8g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，1mL吐温20，0.5mL。
蒸馏水加至1000mL）。
TMB：A 液（TMB20mg，DMSO 10mL，超纯水90mL），B液（一水合柠檬酸2.1g，十二水合磷酸氢二钠7.11g，0.75%过氧化氢尿素0.64mL，加超纯水至100mL），用时将A、B液按1：1比例混合。
终止液：2mol/LH2SO4。
1.2 方法
（1）包被抗原：
用CB包被液将抗原作稀释，使终浓度为0.5ug/ml，每孔加100 微升，37℃孵育两小时。
（2）洗涤：
倒尽板孔中液体，加200微升洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
（3）封闭：
用稀释液将BSA 稀释成浓度为100ug/ml溶液，每孔加150 微升，37℃放置1小时。
（4）洗涤：
同步骤2。
倒尽板孔中液体，加200微升洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
（5）加样：
如下图加样图所示，用稀释液将氯霉素标准品稀释成1.9 ng/mL 至159 ng/mL 溶液，每孔50 微升。
同时作稀释液对照。
同样依照加样图加入被测样，每孔50微升。
图一加样图
（6）加入一抗：
向各孔中加入50 微升抗体，37℃放置 1 小时。
（7）洗涤同2。
（8）加二抗（用稀释液按1:10000 稀释）, 每孔100 微升, 放置37℃1 小时。
（9）洗涤同2。
（10）加底物：
底物溶液加100 微升，室温暗处10--15 分钟。
（11）加终止液：
每孔加入50微升2mol/L H2SO4。
（12）观察结果：
用酶联免疫检测仪记录450nm吸光度读数。
2 结论
450nm下吸光度测量结果如下：（对应加样图顺序）
图二吸光度测量结果
将测得的吸光度值按照公式换算成结合率B/B0(%)：
B/B0(%)＝(OD-Blank)/(OD0- Blank)×100%
其中，OD 为给定样品的吸光度值；OD0为标准蛋白为零时的吸光度值；Blank为空白对照的吸光度值。
以抑制结合率B/B0(%)为纵坐标，浓度的对数值Log10 (CAP)为横坐标作标准曲线。
表一数据处理表
根据第一二列所得吸光度数据的平均值作为标准曲线所用吸光度值，绘制标准曲
线如下：
图三标准曲线
鉴于浓度5.9ng/mL组（即标准曲线第二数据点）远偏离正常水平，删除该数据点后得到新的标准曲线如下：
图四清除可疑点后标准曲线
公式给出如下：
y = -22.061x + 93.594，R² = 0.9308。
取平均值，得到待测样品S1及S2的吸光度值分别为0.4377及0.3370，B/B0值分别为：0.7498与0.5511。
代入标准曲线公式计算得二者的氯霉素浓度对应值为6.982ng/mL与55.498ng/mL。
3 讨论
3.1实验结果中第二数据点的偏差可能是由操作过程失误导致的，比如可能用手触碰96孔板底面透光面，或在倒去板内液体时不慎将液体甩入其他孔。
3.2两待测样品吸光度均在标准曲线标准品吸光度值范围内，可以根据标准曲线推测样品氯霉素浓度值。
在标准曲线中，若删除数据点5，即最后一个数据点（159,0.26），则标准曲线R2值可达到0.9813，因此我们得出标准曲线定量最精确的区间应当在吸光度0.372~0.5645范围内。
3.3ELISA作为一种简便而准确的定量或半定量检测手段，可以在很多场合应用于对目标分子理化性质（主要是抗原结合性）的测量。
但是，同时ELISA也有一些缺点。
在实验中，最适条件的摸索往往需要花费大量时间，同时检测结果也可能出现假阳性或者假阴性。
只有熟练掌握这种方法技能后其优势才能被体现。
参考文献：
[1] 赵淑琴. 酶联免疫吸附测定[J]. 西北国防医学杂志, 1982(2).
[2] 张骥. ELISA技术的研究进展及其医学应用[J]. 临床检验杂志, 1994(S1):59-59.
[3] 吕合作, 李柏青. 免疫印迹法检测信号蛋白的三种显示系统比较[J]. 蚌埠医学院学报, 2002, 27(6):471-472.
[4] 戚红卷, 陈苏红, 王升启. 辣根过氧化物酶(HRP)底物的研究进展[J]. 军事医学, 2007, 31(6):560-563.
[5] 姜国亮. 酶联免疫吸附试验检测人血浆中纤维蛋白原含量[J]. 中国实用医药, 2011, 06(17):97-98. [6]苏薇, 林其燧, 宋耀虹. 酶联免疫吸附试验测定血清苯妥英钠浓度[J]. 中国医学科学院学报, 2000, 22(1):93-96.。