• 无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各 类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施， 其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。
• 无菌检查法的局限性 由于无菌是一个相对的概念， 因此，对无菌检查的结果应该有一个正确的认识－即产品 通过无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品未发现 有微生物污染，并不表示所有的产品都是无菌的。反之， 当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物 污染风险相当高。
豆木瓜蛋白酶消化物
浸出粉…….…2.0g
白酶水解物
………………………………….3.0g 葡萄糖…………....20.0g 磷 „„„„„„„„„3.0g
氯 化 钠 …..…………….…….…5.0g 酸氢二钾………..1.0g
氯化钠 „„„„„„5.0g
磷 酸 氢 二 钾 …………………....2.5g 硫酸镁 一水葡萄糖……………….……2.5g (MgSO4.7H2O)….0.5g
Dextrose(葡萄糖)............................................5.0 g Sodium Chloride(氯化钠).....................................2.5 g L-Cystine( L-胱氨酸) .......................................0.5 g Sodium Thioglycollate (硫乙醇酸钠)..........................0.5 g Agar( 琼脂).................................................0.75 g Resazurin( 刃天青) .........................................1.0 mg Water（水）............................................. ...1000ml
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于7天
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌 、黑曲霉
只要供试品性状允许，应采用薄 膜过滤法
1、0.1％蛋白胨水溶液； 2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 3、其他经验证过的溶液
性状允许的样品采用薄膜过滤 ，利于抗菌影响去除
1．0.1%蛋白胨水溶液； 2．0.1%蛋白胨水溶液＋1ml 吐温80 3．动物组织消化液＋牛肉浸 膏＋吐温80
• 检验数量：是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。 成品每亚批均应进行无菌检查。
• 2015版药典四部通则1101表2，上市抽验样品的最少检验 数量，除抗生素和血液制品外，V≥100ml液体制剂的最少 检验数量由2010年版药典6瓶/支修订为10瓶/支。即所有上 市抽验样品除抗生素和血液制品外的最少检验数量为10瓶/ 支。增加了供试品检验数量。
μm
A级 3520
20
3520
20
微生物监测的动态标准(1)
浮游 菌 cfu/ m3
沉降 表面微生物
菌 接触碟 （f9 / 0mm）（f55 cfu mm） /4h(2) cfu /
5指手 套 cfu /手 套
<1 <1 <1 <1
B级 3520
29
352000 2900
10 5
5
5
C级 352000 2900 3520000 29000 100 50 25
14天于30-35 °C及20-25 °C
菌液制备用培养基的修订来自2010年版金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种到 营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基
生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇 酸盐流体培养基
白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良 马丁培养基或改良马丁琼脂培养基
黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁 琼脂培养基
2015年版
无菌检查： 应在洁净度B级背景下的局部A级 单向流空气区域内或隔离系统中 进行。
微生物限度检查：
微生物限度检查：
应在洁净度10000级背景下的局 应在受控洁净环境下（不低于D
部100级单向流空气区域内进行。 级）的局部不低于B级单向流空
气区域内进行。
修订的依据
修订依据及意义：2010版GMP附录一《无菌药品》和附录三 《生物制品》中均规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环 境应为B级背景下的A级。无菌检查的洁净环境不得低于生产 关键区的洁净环境要求！ ICH：检查方法中要求“试验应在无菌条件下进行，防止微 生物污染的措施不得影响供试品中微生物的检出”。
从理论上来说，要确定某批产品的无菌性，应对每个容器 进行无菌检查。但是无菌试验对样品是破坏性的，因此不 可能对每一最小包装的产品进行检查。
统计概率的局限性 ：对于低污染水平的产品，其局限性 在统计学上更为明显。
检验条件的局限： 样品中污染的微生物的检出受多种因 数的影响，只有在各检验条件符合污染微生物的修复和生 长时，才能保证被检样品的无菌检验结果的准确性。
经培训和认可
硫乙醇酸盐流体培养基
硫乙醇酸盐流体培养基 硫乙醇酸盐流体培养基
30～35℃；20～25℃(三部 ）
改良马丁培养基 23～28℃
均培养14天，
转种后细菌培养2天、真菌培 养3天
30～35℃ 胰酪大豆胨液体培养基
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于4天
30～35℃ 胰酪大豆胨液体培养基
2015年版
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜 培养物接种到胰酪大豆胨液体培养基
或胰酪大豆胨琼脂培养基
生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇 酸盐流体培养基
白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏 葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂
培养基
黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄 糖琼脂培养基
培养基灵敏度检查
采用薄膜过滤，利于抗菌 影响去除 1．0.1％蛋白胨水溶液
2．0.1％蛋白胨水溶液＋ 0.1％（聚乙氧基乙醇、0.1 ％吐温-80） 3．十四烷酸异丙酯。
一次检出结果为准 (设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌 生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试)
磷酸氢二钾„„„„„2.5g 葡萄糖/无水葡萄糖
„„„„„„„2.5g /2.3g
目的
支持广泛微生物的生长,包括需氧菌 用于培养真菌 专性和兼性厌氧菌、真菌（主要是
需氧菌）
培养 条 14天于30-35 °C及20-25 °C 件
14天于20-25 °C
支持广泛微生物的生长,包 括 需氧菌、专性和兼性厌氧 菌、 真菌（主要是需氧菌）
大豆胰酪胨培养基(TSB) & 改良马丁培养基
药典 名称
USP36
BP-2013
Tryptic Soy Broth （Soybean casein digest medium)大豆－胰酪 胨培养基
中国药典2010版 改良马丁培养基
中国药典2015版 胰酪大豆胨液体培养基
配方
胰酪蛋白胨..…………….…..7.0g 大 蛋白胨……………..5.0g 酵母 胰酪胨 „„„„„17.0g 大豆木瓜蛋
2015版中国药典无菌检查法
• 2015版中国药典无菌检查法的修订 • 无菌检查法的方法适用性试验 • 无菌检查法的注意事项
2015版中国药典无菌检查法的修订
• 实验环境的修订 • 检查用培养基的修订 • 具体修订内容
实验环境的修订
2010年版
无菌检查： 应在洁净度10000级背景下的局 部100级单向流空气区域内或隔 离系统中进行。
－
D级 3520000 29000 不作规定 不作规定 200 100 50
－
无菌隔离系统的使用及验证
9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则 •1.操作验证 •2.完整性验证 •3.灭菌验证 •4.灭菌循环验证 •5.内部洁净度验证 •6.仪器仪表验证
培养基的修订
• 我国药典无菌检查法与欧美药典的差异 • 2015版药典的修订
方法适用性试验的修订
2010年版
硫乙醇酸盐流体培养基接种小于 100cfu的菌液： 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
改良马丁培养基接种小于100cfu的 菌液：
白色念珠菌 黑曲霉
2015年版
硫乙醇酸盐流体培养基接种小于 100cfu的菌液： 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌
胰酪大豆胨液体培养基接种小于 100cfu的菌液： 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉
生物制品的无菌检查中硫乙醇酸盐流体培养基为双份， 分别置30～35℃、20～25℃两个温度培养。
USP/EP/BP/JP/ICH无菌检查法中对生物制品均没有作 出特殊规定。
无菌检查方法的主要修订
• “方法验证试验”修订为“方法适用性试验” • “若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检验方法应
重新验证”修订为“若检验程序或产品发生变化可能影响 检验结果时，应重新进行方法适用性试验。” • “方法适用性试验”培养时间由“3～5天”修订为不得超 过5天。
2015版中国药典通则
9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则
GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
洁 静态 净
动态
度
级 ≥0.5
≥5.0 ≥0.5
≥5.0
别 μm
μm μm
培养基的主要修订
2010年版 硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃（20～25℃）
改良马丁培养基 23～28℃