理论上 61 gaatctggta gaagtgagtt ttggatagta aaataagttt cgaactctgg cacctttcaa
121 ttttgtcgca ctctccttgtt tttgacaatg caatcatat gcttctgcta tgttaagcgt
目的基因片段长度：330bp 181 attcaacagc gatgattaca gtccagctgt gcaagagaat attcccgctc tccggagaag
分子生物学实验
一、人类基因组DNA提取 二、PCR技术 三、RFLP技术
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实验流程图
采集血液样本
提取基因组DNA
基因位点的PCR扩增
琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物
PCR产物酶切
琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物
DNA凝胶成像系统判读基因型
统计分析各等位基因频率
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一、人类基因组DNA提取 材料：生物组织、培养细胞、血液样品 常规提取基因组DNA主要步骤： 1.破碎细胞： （1）物理方法：超声波、匀浆、液氮研磨 法等（易导至DNA链的断裂 ） （2）化学等温和方法（获得大分子量DNA）
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引物：能与模板DNA两条链上的各一 段序列互补的寡核苷酸（15～20bp）
SRY基因引物：
上游引物：5′GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG3′ 下游引物：5′CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTC 3' 扩增DNA片段长度：330bp
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SRY基因部分序列
1 gttgaggggg tgttgagggc ggagaaatgc aagtttcatt acaaaagtta acgtaacaaa
1OD260单链DNA或RNA≈40μg/ml 样品纯度判定：OD260/ OD280 ≈ 1.8～2.0 DNA或RNA较纯
OD260/ OD280 ﹤1.8 有蛋白质或酚污染 9
三、PCR技术原理及应用
聚合酶链反应（PCR）： 利用耐热DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合
酶）,以一对与模板DNA互补的寡核苷酸为 引物，在体外模拟体内的DNA复制过程，即 进行变性、退火和延伸三个阶段（循环30 次），使目的DNA扩增到106个拷贝。
蛋白酶K；白细胞裂解液
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2.去除蛋白质、多糖和脂类等大分子物质 如：去除蛋白质方法：酚、氯仿抽提法
饱和NaCl盐析法 3.沉淀DNA，去除盐类 沉淀DNA：用乙醇、异丙醇或聚乙二醇
析出的DNA→ DNA沉淀 去除盐类：用75%乙醇洗涤，去除盐类 用TE水化DNA
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血ห้องสมุดไป่ตู้样本中基因组DNA提取
1.样本预处理 取被检测对象肘静脉血3ml于加有 0.5mlACD抗凝剂的真空采血管中，并立刻颠倒混匀。若 不立即提取基因组DNA，样本可于-20℃冰箱保存数月， 若长期保存，应将样本置于-80℃冰箱； 2.将血液样本用吸管移到新的20ml或50ml离心管中（鲜 血直接操作，冰冻标本取出室温融解后再操作）； 3.裂解红细胞 红细胞裂解液加至9ml，振荡混合室 温放置10min，期间于旋涡振荡器或颠倒混合数次，然 后3000r/min离心10min，弃上清；
10. 水 化 DNA 加 入 适 量 体 积 （ 100 ～ 300μl ） 的 1×TE缓冲液，摇床上轻摇数小时，室温溶解至少24h 后，4℃冰箱放置数天，分装，-20℃保存。
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提取DNA流程图 样本血液
裂解红细胞 裂解白细胞 沉淀蛋白质 析出DNA 清洗DNA 水化DNA
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二、DNA浓度及纯度测定
吸取5μl DNA样品加双蒸水至1ml，混匀后，转入 1ml 石 英 比 色 杯 中 于 DNA/RNA/ 蛋 白 测 定 仪 中 测 定 260nm、280nm处的吸光度，DNA/RNA/蛋白测定仪先 用1ml双蒸水校正零点。 DNA 在260nm紫外区吸收最强。
DNA样品浓度=OD260×200×50（μg/ml） DNA样品纯度= OD260/ OD280 DNA样品浓度计算：1OD260双链DNA≈50μg/ml
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8.析出DNA 将离心后的上清液倾入装有4ml 4℃异 丙醇的新离心管中，轻摇至出现白色絮状物，即析出 的DNA物质。用移液器枪头挑出DNA至1个新的1.5ml的 Eppendorf 管中 ， 如无 絮 状物 或 DNA 较细 小 时 ， 应再 4000r/min离心5min，倒置留沉淀；
9.用1ml75%乙醇清洗DNA沉淀1～2次，12,000 r/min离 心5min，去上清液，敞盖室温放置15～20min，待其自 然干燥 (注:不能使DNA完全干燥，否则极难溶解)；
241 ctcttccttc ctttgcactg aaagctgtaa ctctaagtat cagtgtgaaa cgggagaaaa 301 cagtaaaggc aacgtccagg atagagtgaa gcgacccatg aacgcattca tcgtgtggtc 361 tcgcgatcag aggcgcaaga tggctctaga gaatcccaga atgcgaaact cagagatcag 421 caagcagctg ggataccagt ggaaaatgct tactgaagcc gaaaaatggc cattcttcca 481 ggaggcacag aaattacagg ccatgcacag agagaaatac ccgaattata agtatcgacc 541 tcgtcggaag gcgaagatgc tgccgaagaa ttgcagtttg cttcccgcag atcccgcttc 601 ggtactctgc agcgaagtgc aactggacaa caggttgtac agggatgact gtacgaaagc 661 cacacactca agaatggagc accagctagg ccacttaccg cccatcaacg cagccagctc 721 accgcagcaa cgggaccgct acagccactg gacaaagctg taggacaatc gggtaacatt
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4.重复上一步骤至红细胞裂解完全，即管底不再出现 红色沉淀为止； 5.加蛋白酶K20μl，振荡； 6.裂解白细胞 向离心管中加入4ml白细胞裂解液， 充分振荡混匀后，放入37℃水浴箱温浴15min； 7.沉淀蛋白质 从恒温水浴箱中取出离心管，冷水中 放置几分钟，使温度降至室温，而后加入冷冻的蛋白 沉 淀 液 （ -20℃ 放 置 ） 1ml ， 充 分 混 合 均 匀 ， 4000r/min离心10min；