TE：10mM Tris.CL （pH8.0），1mM EDTA 溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0，
新鲜配制）
❖ 溶液Ⅰ—溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。
❖ 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH， 1% SDS。
M pBSK pGFP
质粒DNA提取常见问题
问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
原 因
1. 菌体老化 2. 碱裂解不充分 3. 菌体中无质粒 4. 溶液使用不当
1. 请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养
2. 可减少菌体用量或增加溶液 的用量
对
3. 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素
原理示意图
质粒DNA电泳
电场中DNA分子的迁移速度取决于： ❖ DNA分子本身的大小 ❖ DNA分子的空间构型
超螺旋构型（ccDNA) 线形DNA(lDNA) 开链环状DNA(ocDNA) 复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起)
•溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核 酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙 色荧光
培养3-4小时（OD600＝1.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 ℃离心30
秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并 重复一次，弃上清，取沉淀。
步骤二 质粒提取
1. 取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm， 4℃，离心30sec，弃上清。
9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗 DNA沉淀。12000 rpm，4 ℃离心2分钟。
10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置 5min。室温放置15min干燥。
11．50µl TE缓冲液(含无DNase的RNase 20 µg/ml)，使DNA完全溶解（-20℃保存）
12．取样品10 µl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼 脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。
Attention, please!
❖ EB是强诱变剂，配制和使用EB染色液时， 应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将 该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB 的器皿或物品，必须进行清洗或弃去！
质粒提取实验材料与试剂
❖ 实验材料： 过夜培养大肠杆菌DH-5a ❖ 实验试剂：
LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL （pH8.0）、1mM EDTA、Amp 50mg/ml、酚、 氯仿、Rnase、琼脂糖
分离质粒DNA的 基本步骤
❖ 培养细菌使质粒扩增； ❖ 收集和裂解细菌； ❖ 分离和纯化质粒DNA
质粒DNA的提取方法
❖ 碱变性法（碱裂解法）； ❖ 煮沸裂解法； ❖ 羟基磷灰石柱层析法； ❖ 质粒DNA释放法； ❖ 酸酚法等。
碱变性（裂解）法基本原理：
在碱性条件下（pH 12.6），染色体DNA的氢键断裂，双 螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双 螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链 不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时， 变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不 能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力 密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合 物等一起沉淀下来而被除去。
2. 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。
3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入10 µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放 置1分钟。
4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf 管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将 Eppendorf管放在冰上3分钟 。
❖ 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液： 5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。
步骤一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中（含Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。
（活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基5度是否正确。
4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，置于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
质粒DNA提取常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？
原
1. 不要使用过多菌体。重新纯化
因
DNA，去除蛋白、多糖、多酚
等杂质
1. 混有蛋白
2. 混有RNA
对 2. 加入RNaseA室温放置一段时间
5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000rpm， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一 1.5ml Eppendorf管中。 7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放 置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去 上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。
碱变性法小量提取质粒， DNA的限制性酶切
厦门大学医学院 分子生物学实验教学组
实验目的
❖ 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 ❖ 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基
因和实验目的选择合适载体与限制性内切 酶，设计构建体外重组分子。
质粒(plasmid)
❖ 是• 染是色染体色外体能外够能进够行进自行主自复主制复的制遗的传遗单传位单，位， 包括包真括核真生核物生的物细的胞细器胞（器主（要主指要线指粒线体粒和体和 叶绿叶体绿）体和）细和菌细细菌胞细中胞染中色染体色以体外以的外D的NDANA 分子分，子在，基在因基工因程工中程质中粒质常粒被常用被做用基做因基的因的 载体载。体。
3. 混有基因组DNA
策
3. 加入溶液II 和III后防止剧烈振荡 ，可能把基因组DNA剪切成碎