藏药巴桑母酥油丸对放射线-化学复合损伤小鼠粒-巨噬系造血功能的影响及机理研究黄晓芹;卫莉玲;黄茜;降央泽仁【摘要】目的探讨藏药巴桑母酥油丸对放射线-化学复合损伤小鼠粒-巨噬系造血功能的影响及可能机理.方法 60 Coγ射线照射和环磷酰胺腹腔注射方式制造放射线-化学复合损伤小鼠模型,采用外周血细胞计数、造血祖细胞集落分析、实时荧光定量PCR,检测灌胃不同浓度巴桑母酥油丸后不同时间放射线-化学复合损伤小鼠外周白细胞数、骨髓粒-巨噬系(CFU-GM)造血祖细胞集落产率、粒-巨噬系集落刺激因子(GM-CSF)和粒-巨噬系集落刺激因子受体(GM-CSF R) mRNA相对表达量.结果灌胃14 d后,中、高剂量组的白细胞数显著高于生理盐水组;中剂量巴桑母酥油丸灌胃14 d后,骨髓CFU-GM集落产率、GM-CSF mRNA和GM-CSFR mRNA 也显著高于空白组、生理盐水组.结论适当浓度的巴桑母酥油丸可以通过上调骨髓GM-CSF、GM-CSFR mRNA表达、促进CFU-GM增殖分化,进而促进放射线-化学复合损伤后小鼠外周血白细胞数的提前恢复.【期刊名称】《四川动物》【年(卷),期】2014(033)001【总页数】5页(P113-117)【关键词】巴桑母酥油丸;放-化疗;小鼠;白细胞;粒-巨噬系祖细胞;粒-巨噬系集落刺激因子【作者】黄晓芹;卫莉玲;黄茜;降央泽仁【作者单位】成都中医药大学民族医药学院,成都611137;雅安职业技术学院附属医院,四川雅安625000;成都中医药大学民族医药学院,成都611137;成都中医药大学民族医药学院,成都611137【正文语种】中文【中图分类】R285.5放、化疗是现代医学治疗恶性肿瘤重要甚至唯一的手段，骨髓抑制及由此带来的造血功能低下是放、化疗最严重、最根本的毒副作用。
由于骨髓不均匀地分布于骨小梁间隙的特点，其损伤程度不便于直接测量，常采用外周血细胞数，尤其是白细胞数量的下降来反映(Hu & Cucinotta，2011)，而贫血、出血、白细胞减少及由此带来的身体虚弱、抵抗力下降等症状，符合藏医“七精耗损、身体虚弱”的“补益”疗法实用范围(第司·桑吉嘉措，2012)。
巴桑母酥油丸是藏医补益根本方剂之一，据藏医经典著作《四部医典》记载，“巴桑全身皆益” (宇妥·云丹衮波，2011)即：巴桑母酥油丸“对身体上下之各种疾病均有裨益”。
本研究拟以放射线-化学复合损伤小鼠模拟病人放、化疗后状态，研究巴桑母酥油丸对放、化疗后粒-巨噬系造血的具体影响和可能机制，探讨巴桑母酥油丸在放、化疗后外周血白细胞数恢复中的可能作用，为缓解肿瘤病人放、化疗后毒副作用，提高病人生存质量和生存年限另辟蹊径。
1.1 实验动物8～12周龄雄性C57BL6J 小鼠，购于四川大学实验动物中心，动物许可证号SCXK(川)2009-09。
动物饲养条件：20～25℃，自由接受冷开水和C57BL6J小鼠配方颗粒饲料(四川大学实验动物中心购买)喂养，每2 d换1次消毒干燥垫料。
1.2 药品及试剂巴桑母酥油丸(Basangmu Suyou Wan，西藏藏医学院藏药有限公司，批号101201)，用生理盐水稀释溶解至所需浓度，4℃贮存备用，用前加热混匀；IMDM培养基(美国Invitrogen公司，批号1282295)，特级马血清(北京元亨圣马生物技术研究所，批号110320)；重组小鼠粒-巨噬系集落刺激因子(Peprotech，批号050755-1)；逆转录试剂盒(Eu Fermentas公司，批号00098448)；Taq DNA PCR反应试剂盒(TaKaRa大连宝生物，批号ck3501AA)；Trizol(美国Invitrogen，批号50563209)；dNTP(美国Promega，批号251230)；DNA分子量标准(DNA Marker：Marker I，显示条带：100、200、300、400、500、600 bp，北京康为世纪公司，批号16911K)；琼脂糖(电泳级，GENE TECH上海有限公司，批号111760)。
1.3 主要仪器设备60Coγ源(四川省农业科学院生物技术核技术研究所辐照中心)；全血细胞自动计数仪(奥地利Abacus Junior，型号VET 130004-动物专用3分类)；CO2培育箱(日本SANYO公司，型号MCD-15A)；超净工作台(北京半导体设备厂，型号JJT-900/1300)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司，型号CX-1O)；实时荧光定量基因扩增仪(加拿大FUNGLYN，型号FTC2000)；水平电泳仪(美国BIO-RAD，型号Powerpac Basic TM)；凝胶成像系统(美国BIO-RAD，型号Gel Doc 1000)。
1.4 放射线.化学复合损伤小鼠制备小鼠经60Coγ射线2Cy照射，照射后第4天，经腹腔注射环磷酰胺40mg/(kg·d)，qd×3 d，视为造模完成(黄晓芹等，2009)(以下简称：放-化复合损伤小鼠或60Co-Cy injury mice)。
1.5 外周血白细胞数检测小鼠于造模完成后第2天开始分别灌胃0.75 g·k g-1·d-1(低剂量组)，1.5 g·kg-1·d-1(中剂量组)，3.0 g·kg-1·d-1(高剂量组)的巴桑母酥油丸乳液和等体积生理盐水(生理盐水组)，每天1次，同时设立造模后自然恢复小鼠组(空白组)。
于灌胃的3 d、7 d、14 d、20 d，各取10只小鼠，麻醉后去眼球取全血，用动物专用全血细胞自动计数仪计数白细胞(WBC)数。
1.6 骨髓CFU.GM集落产率检测造模后小鼠灌胃1.5 g·kg-1·d-1巴桑母酥油丸14 d后，在无菌条件下分离骨髓细胞(BMC)，进行粒-巨噬系祖细胞培养，培养时间7 d，第8天于显微镜下(放大40倍)直接计数集落数，以50个细胞以上为1个集落。
1.7 骨髓GM-CSF mRNA和GM-CSFR mRNA 相对表达量检测造模后小鼠灌胃1.5 g·kg-1·d-1巴桑母酥油丸14 d后，分离骨髓细胞，按常规方法提取总RNA，进行琼脂糖凝胶电泳检验，确认总RNA提取完整无降解后按试剂盒要求进行逆转录。
逆转录后进行常规PCR，确认引物合成正确后进行实时荧光定量PCR。
ACTB基因作为内参基因同时进行扩增。
所用引物为：1.小鼠GM-CSF(M-GM-CSF)：引物：M-GM-CSFF，5’-AACTCCGGAAACGGACTGT-3’；M-GM-CSFR，5’-CTCATTACGCAGGCACAAAAG-3’；探针：M-GM-CSFTaqMan probe，5’-TCAGAGCTGGCCTGGGCTTCCT-3’，扩增产物长度为178 bp。
2.小鼠GM-CSFR (M-GM-CSFR)：M-CSFRF：5’-CACTGGAGGCTGAG-CTTCGTCA-3’；M-CSFRR，5’-GTCGTGACCCGTGGA-GTTGAGG-3’；探针：M-CSFRTaqMan probe：5’-CCTGACCTGCGAGATCCGAGCC-3’，扩增产物长度为168 bp。
3.内参：β-肌动蛋白(Beta-actin，ACTB)：引物：ACTBF：5’-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3’；ACTBR：5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCACA-3’；探针ACTBTaqMan：5’-TCACTGTCCACCTTCCAGCAGA-3’，扩增产物长度为111 bp。
引物合成及探针修饰：上海生物工程有限公司。
反应条件为94℃×2 min；94℃×20s/55℃×30 s/60℃×40 s，45个循环。
记录每一样品目的基因和ACTB基因Ct值(Cyclethreshold)，将原始数据(Ct值)换算为基因的相对表达量(2-ΔΔCt)后，分析比较初始基因表达量。
1.8 实验数据的统计处理数据以均值±标准差表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为有显著性差异。
2.1 巴桑母酥油丸对放.化复合损伤小鼠外周血白细胞数的影响灌胃不同浓度巴桑母酥油丸3 d、7 d、14 d、20 d后，各组小鼠外周血白细胞数见表1。
从表中可以看出随着时间的延长，各组小鼠的白细胞数都逐渐增加；在7 d 后，高剂量组的白细胞数显著高于空白组，但与其余各组间没有显著性差异；灌胃14 d后，中、高剂量组的白细胞数显著高于空白组和生理盐水组，但与低剂量组没有显著性差异；灌胃20 d时，高剂量组的白细胞数显著高于空白组，而与其余各组间没有显著差异。
2.2 巴桑母酥油丸对放.化复合损伤小鼠骨髓CFU.GM集落产率的影响培养的CFU-GM集落见图1，灌胃14 d后，空白组、生理盐水组、巴桑母酥油丸组的骨髓CFU-GM集落产率分别为47.50±7.10、45.25±7.59、51.00±6.97(5×104BMC)，巴桑母酥油丸组显著高于空白组和生理盐水组(P<0.05，图2)。
2.3 巴桑母酥油丸对放.化复合损伤小鼠骨髓细胞GM-CSF mRNA和M-CSFR mRNA相对表达量的影响各组目的基因的相对表达量见图3，从图中可以看出：空白组、生理盐水组、巴桑母酥油丸组的GM-CSF mRNA和GM-CSFR mRNA相对表达量分别为3.03±2.16、2.90±0.96、5.76±1.80和1.44±0.88、1.97±0.71、2.84±0.28(2-ΔΔCt)，巴桑母酥油丸组均显著高于空白组和生理盐水组(P<0.05)。
由于低剂量辐射联合环磷酰胺可使机体肿瘤细胞产生G1期阻滞，对肿瘤增殖细胞杀伤作用增强，明显提高机体抗肿瘤的作用，故在肿瘤治疗中具有一定的实际意义(于洪升等，2004)。
但电离辐射和烷化剂类的环磷酰胺可通过损伤DNA(Cortellino et al., 2004；徐宏贵等，2007)，阻止其复制、延迟细胞分裂、加速细胞调亡等途径，导致骨髓抑制。
放、化疗双重因素共同作用时，骨髓造血功能抑制更为明显(Larson & Le Beau，2005)，因而采用Co60γ射线照射联合环磷酰胺注射方式可以建立模拟放、化疗后病人机体功能状态的动物模型，进行相关研究。
由于单纯运用细胞因子，无法达到促进放、化疗后外周血细胞数稳定恢复的理想效果，传统补益药物在该领域的独特效果得到广泛的研究和运用(左晶晶，2011；刘红卫等，2012)。