辨证论治联合手术及化疗对H22肝癌小鼠疗效的观察王艳明1，2方肇勤1张园园1潘志强1卢文丽11．上海中医药大学基础医学院（上海201203）2．河北省廊坊市妇幼保健中心（河北廊坊065000）【摘要】目的：探索建立同病异证H22肝癌小鼠中药个体化辨证论治联合手术及化疗的综合治疗方案及初步评价其疗效。
方法：采用H22肝癌细胞腋下实体瘤小鼠及小鼠标准化、计量化辨证方法，观察中药个体化辨证论治联合手术及化疗的综合治疗方案对小鼠带瘤生存时间、抑瘤率和证候等的综合疗效。
结果：建立了中药个体化辨证论治联合手术及化疗方法，该方法在抑瘤率、术后早期生存率，以及改善小鼠免疫紊乱与衰退方面显示出一定的优势。
结论：在实验室可以模拟临床，建立起肿瘤小鼠个体化辨证论治联合手术及化疗方法，为综合治疗方案的探索、优化和提高提供了方法学。
【关键词】肝癌；小鼠；辨证论治；中西医结合；方法学【中图分类号】R285．5【文献标志码】A 【文章编号】1008-861X （2012）04-0087-05［基金项目］国家科技重大专项课题（2009ZX09502-018）［作者简介］王艳明，女，在读硕士生，主治医师，主要从事中医学证和辨证论治的研究。
［通讯作者］方肇勤，教授，博士生导师。
E-mail ：zqfang@sh163．net原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，发展迅速，病死率高，严重危害着患者的生命健康。
当前，原发性肝癌治疗的首选是手术，当不具备手术指征时，常采用肝癌局部介入化疗和物理疗法，放疗也有采用。
在我国，大多肝癌患者会主动寻求中医药治疗，因此，中西医结合治疗成为肝癌治疗的主要模式。
中医药防治肝癌主要采取辨证论治的方法，针对肝癌邪毒、痰瘀、脾虚等主要病机，以及不同患者的特殊证候，予以清热解毒、行气活血、化痰软坚、健脾益气等综合治疗及个体化的辨证论治［1-3］。
项目组在前期的研究中发现肝癌小鼠与人类近似，存在着证候的自然发生、兼夹和演变，是肝癌辨证论治研究的理想模式生物［4］，并逐步建立起大鼠和小鼠标准化诊法和辨证方法［5-9］，尝试开展了以中药复方为主的辨证论治［10-11］，取得了积极的进展。
并在以往的试验中利用基因芯片的检测发现同病异证的肝癌小鼠在神经-内分泌系统存在一些重要激素的表达特征，具有各自的物质基础［12］。
为了模拟临床实际，建立肝癌小鼠中西医结合治疗方法，并以此为基础，不断探索和优化中西医结合肝癌防治方法、揭示中西医结合防治肝癌的作用机制，我们在以往工作的基础上，进一步探索中药辨证论治联合手术及介入化疗对H22肝癌小鼠的治疗及疗效评价，报道如下。
1材料与方法1．1实验动物健康雄性昆明小鼠140只，体质量（25ʃ1）g ，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号为SCXK （沪）2008-0003，动物使用许可证号为SYXK （沪）2009-0069。
1．2药物1．2．1中药方剂（1）基本方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡索10g ，当归10g ，川芎10g ，桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神曲10g 。
（2）气虚方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡索10g ，当归10g ，川芎10g ，桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神曲10g ，生晒参10g ，黄芪15g ，白术10g ，阿胶10g 。
（3）阳气虚方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡索10g ，当归10g ，川芎10g ，桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神曲10g ，生晒参10g ，黄芪15g ，白术10g ，阿胶10g ，淫羊藿10g ，山茱萸10g ，杜仲10g 。
（4）气阴阳虚方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡索10g ，当归10g ，川芎10g ，桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神曲10g ，生晒参10g ，黄芪15g ，白术10g ，淫羊藿10g ，山茱萸10g ，杜仲10g ，阿胶10g ，熟地黄20g ，炙鳖甲10g ，炙龟甲10g 。
中药制备：以上4方均按标准的中药水煎醇沉方法，浸膏分别浓缩至1g /ml 。
1．2．2局部介入用化疗液每0．2ml 含5-Fu0．125mg 、丝裂霉素0．0025mg 、顺铂0．005mg 。
1．3造模、分组及治疗随机取30只小鼠作正常对照组；其余110只小鼠的右腋下皮下接种H22肿瘤腹水癌细胞（4ˑ107个/ml ）0．2ml 。
出瘤后开展第一次诊法与辨证（计为1d ），将“邪盛衰度”，作为分组的主要依据。
手术治疗：取邪盛衰度与手术组近似小鼠30只，作对照组；其余80只肝癌小鼠，给予20%的乌拉坦0．1ml /10g ，腹腔注射麻醉，碘伏消毒皮肤，备皮，于四诊后第2天手术摘除肿瘤，术后缝合。
术后第4天尚存活70只小鼠，开展第二次诊法与辨证（计为6d ）。
依据术后气、血、阴、阳证候程度分层分组，将手术后肝癌小鼠分为手术化疗组（术化组），手术化疗加中药组（中西组），每组30只，以保证各组的气、阴、阳、血盛衰程度近似。
其余10只见有严重虚证小鼠淘汰。
治疗：①正常组：纯水灌胃，0．5ml /d ；②对照组：纯水灌胃，0．5ml /d ，肿瘤局部注射0．2ml0．9%NaCl 溶液；③术化组：纯水灌胃，0．5ml /d ，肿瘤局部注射0．2ml 化疗液；④中西组：中药辩证论治方灌胃，0．5ml /d ，肿瘤局部注射0．2ml 化疗液。
以上化疗每4d 注射1次。
中药辨证论治方法：期间分别于第6天、11天四诊和辨证，根据各小鼠气血阴阳盛衰程度调整中药处方。
鉴于术后小鼠气虚、阴虚严重，第6天起有22只小鼠采用了气阴阳虚方、7只小鼠采用了气虚方、仅1只小鼠采用基本方；随着后续证候有所改善，第11天起仅10只小鼠采用气阴阳虚方、10只小鼠采用气虚方、6只小鼠采用基本方，另4只小鼠体质过弱及死亡未给中药治疗。
1．4四诊计量化检测方法与计量辨证方法采用课题组已建立的小鼠标准化四诊检测方法和计量辨证方法，具体方法参见有关文献［5-9］。
估算瘤体积（cm 3）=abb /2（a 代表体表测量肿瘤的长径，b 代表体表测量肿瘤的短径，单位cm ）。
邪盛衰度=某肝癌小鼠瘤体积/所有肝癌小鼠瘤体积均数。
气盛衰度=某小鼠抓力/正常组小鼠抓力均数ˑ0．5+某小鼠水平跨格数/正常组小鼠水平跨格数均数ˑ0．3+某小鼠垂直站立次数/正常组小鼠垂直站立次数均数ˑ0．2。
阳盛衰度=某小鼠腋温/正常组小鼠腋温均数。
阴盛衰度=某小鼠去瘤体重/正常组小鼠体重均数。
血盛衰度=某小鼠爪r /正常组小鼠爪r 均数ˑ0．7+某小鼠尾r /正常组小鼠尾r 均数ˑ0．3。
辨证标准与辨证论治：①气虚辨证标准：与正常组比较，＜0．75为气虚；予气虚方治疗。
②阳虚辨证标准：与正常组比较，＜0．98为阳虚；予阳气虚方治疗。
③阴虚辨证标准：与正常组比较，＜0．85为阴虚；予气阴阳虚方治疗。
④无气、阴、阳虚者，予基本方治疗。
不设针对血虚处方。
1．5疗效观察与评价至所有肝癌小鼠死亡达50%时，结束实验。
分析带瘤生存时间和存活数；称取各组小鼠肿瘤、脾脏、胸腺重量，计算抑瘤率；分析各组治疗前后邪、气、阳、阴、血等盛衰度演变及疗效。
1．6统计学方法采用SPSS 15．0统计软件包处理，实验数据为计量资料用x ʃs 表示，肿瘤、胸腺、脾脏，治疗后与治疗前证候比均采用单因素方差分析。
各组小鼠每天存活率比较采用行ˑ列表的χ2检验，多个样本率比较。
2结果2．1存活率及抑瘤情况2．1．1存活率实验结束之际，小鼠存活数以术化组较多，尚存活16只；其次为对照组，存活13只，中西组存活11只。
其中术化组和中西组在第8天 12天存活数与对照组比较，差异有统计意义（P ＜0．05），至第13、14天两个治疗组出现集中死亡。
见图1、图2。
注：与对照组比较，术化组和中西组▲P ＜0．05。
图1各组小鼠的存活率图2各组小鼠的存活数2．1．2瘤重肝癌小鼠术后肿瘤均出现复发。
治疗后，与对照组比较，术化组和中西组瘤重显著降低，差异有统计学意义（P ＜0．05），抑瘤作用明显。
见图3、图4。
注：与对照组比较，术化组和中西组▲P ＜0．05。
图3各组小鼠瘤重图4各治疗组抑瘤率2．2不同组别肝癌小鼠的证候演变2．2．1邪盛衰度肝癌小鼠肿瘤切除，邪盛衰度下降为0；至第6天肿瘤术后出现复发，但术化组和中西组与对照组比较仍有显著减轻邪毒程度的作用，差异有统计意义（P ＜0．05）；随着术后复发肿瘤迅速增殖，治疗组邪盛衰度逐渐增加，而对照组肿瘤体积大者先后死亡，遂使邪盛衰度3个组接近，仅中西组与对照组比较差异有统计意义（P ＜0．05）。
治疗结束之际，各组因样本减少，邪盛衰度差异无统计意义（P ＞0．05）。
同样，治疗前后比较，中西组邪盛衰度增幅最小，但差异无统计意义（P ＞0．05）。
见图5、图6。
注：与对照组比较，术化组和中西组▲P ＜0．05；与对照组比较，术化组△P ＜0．05。
图5各组小鼠肿瘤邪盛衰度演变图6各组小鼠邪盛衰度治疗前后比较2．2．2气盛衰度对照组小鼠肿瘤发生后，自发形成气虚，其中6d 、11d 与正常组比较，差异有统计意义（P ＜0．05），伴随着邪毒壅盛和气虚小鼠陆续死亡，致存活小鼠气盛衰度得到改善；治疗组手术耗伤气血，以后叠加肿瘤复发因实致虚，遂使6d 、11d 、14d 与正常组比较，差异有统计意义（P ＜0．05）。
这也使得虽然对证加强了益气治疗，仍未能阻止气虚的发展。
见图7、图8。
注：与正常组比较，对照组▲P ＜0．05；与正常组比较，术化组和中西组△P ＜0．05。
图7各组小鼠气盛衰度演变图8各组小鼠气盛衰度治疗前后比较2．2．3阳盛衰度本实验肝癌小鼠未见阳盛衰度明显的变化，治疗前后变化亦不明显。
见图9、图10。
2．2．4阴盛衰度肿瘤手术伤及气血阴阳，与正常组比较，治疗组术后表现为阴虚并延续，差异有统计意义（P ＜0．05），至实验结束仍未恢复，差异有统计意义（P ＜0．05）。
对照组小鼠伴随着邪毒壅盛和阴虚小鼠陆续死亡，致使存活小鼠阴盛衰度维持在接近正常对照的水平。
因此，治疗前后与正常组比较，两个治疗组未能纠正阴虚的发展，差异有统计意义（P ＜0．05），而两者间差异无统计意义（P ＞0．05）。
见图11、图12。
2．2．5血盛衰度肿瘤手术伤及气血阴阳，与正常组比较，治疗组术后表现为血虚并延续，差异有统计意义（P ＜0．05），至实验结束尚未恢复，差异有统计意义（P ＜0．05）。