二、柠檬酸及其盐的应用概况
1、在食品工业中的应用
酸味剂、增溶剂、抗氧化剂，除腥脱臭剂； 1、饮料 据统计75%～80%的柠檬酸用于饮料工业。 2、果酱与果冻 3、糖果 4、冷冻食品 5、酒类 6、冰淇淋和酸奶 7、脂肪与油 8、腌制品 9、罐头食品和水果加工 10、豆制品和调味品
三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制
（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1、磷酸果糖激酶（PFK）：
Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响
Mn2+ 缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？ 当培养基中Mn2+ 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸 （GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着 体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到 影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。
国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设 备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。
第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控
一、柠檬酸合成途径的发现





柠檬酸合成机制是在阐明酒精发酵机制和TCA循环学说 提出的基础上才逐渐弄清楚。 1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶； 1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢； 1958年，MeDonugh等发现黑曲霉在柠檬酸生产的条件下， 存在HMP途径，且主要存在于孢子形成阶段。 1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中存在TCA 循环
4、在美容品、化妆品中的应用
在发蜡中应用：柠檬酸调节pH和金属离子螯合剂， 柠檬酸与柠檬酸钠配成缓冲溶液保持pH4.5～5.0，增 强发蜡的防腐作用 在洗发剂中的应用：去头皮屑、增加头发的光泽、 恢复头发弹性
生产泡腾型牙齿清洁剂
三、我国柠檬酸生产现状

生产状况： 60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界
2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。
3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA
（二）三羧酸循环的调节
1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个 酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。 2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节： 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸 正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线 粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡： 柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。 顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬 酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L， 铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵 中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。
第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生 产厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生 物化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡 罗氏中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安 徽华源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。

存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上

4. 选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株

思考题
1、柠檬酸发酵过程中有哪些控制要点，如何控制？
2、说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。 3、简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产率的意义。
2、在医药工业中的应用
胃药和收敛剂，主要成分柠檬酸铋钾 泻药：柠檬酸镁，用于X光透视前的清肠和治疗便秘 稳定剂：利用柠檬酸的缓冲能力，维持活性配料的稳 定性，同时可起到防腐作用 掩盖剂：和水果香精合用，掩盖药物的苦味
3、在化学工业中的应用
去垢剂：柠檬酸能增加去污能力，在许多家用去垢剂 产品中可加快生物降解，作为磷酸盐的代用品，大量用 于洗衣粉、去污剂中。 金属净化：柠檬酸是高效鳌合清洗剂，对钙镁铁铜等 污垢有效，广泛用于金属表明的清洗，洗后废水可生物 降解不污染环境。
3. 不分解柠檬酸的菌株

原理：不利分解柠檬酸的菌株，说明其TCA循环中柠檬 酸后续酶的活性较低或者丧失，这有利于积累柠檬酸。 方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变 株。 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会 使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的 形成。 （为何？中间产物少，C架少，不利于合成代谢……）
二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径

黑曲霉利用糖类发酵 生成柠檬酸的合成途 径是：葡萄糖经 EMP、HMP途径降 解生成丙酮酸，丙酮 酸一方面氧化脱羧生 成乙酰CoA，另一方 面经CO2固定化反应 生成草酰乙酸，草酰 乙酸与乙酰CoA缩合 生成柠檬酸。
(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者 EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1 (2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环， 在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛 酸循环被阻断或减弱。 (3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是 由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化 生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮 酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。
抑制，使EMP畅通无阻。 （2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。
（3）控制培养基中的Fe2+ 的浓度，使顺乌头酸水
合酶失活。
五、柠檬酸产生菌育种的传统方法
1. 透明圈大的菌株

平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好
2. 显色圈大小

平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。
小结：
①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，有一条呼吸活动强的 不产生ATP的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节， 促进EMP途径畅通。 ②丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱 羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸 合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。 ③顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。 ④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和 异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。
（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸
乙醇乙酸

3醋酸 1柠檬酸 生成的柠檬酸一半转化为 异柠檬酸 酵母N源耗尽后开始烷烃 发酵，低浓度AMP抑制 NAD-异柠檬酸脱氢酶的 活性，柠檬酸大量合成并 积累。此时顺乌头酸水合 酶催化反应平衡为：柠檬 酸：异柠檬酸：顺乌头酸 = 90：7：3。细胞质中积 累大量异柠檬酸。
第五章 柠檬酸发酵机制
重点：柠檬酸生物合成途径； 柠檬酸生物合成的代谢调节机制。 难点：柠檬酸生物合成的代谢调节机制。
第一节 概述
一、柠檬酸简介

柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，英文文 献俗名citric acid，是生物体主要代谢产物之一。分 子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭、味极酸，易 溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性。
3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节 在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特 点是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻 遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内 不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。 α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不 可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起： ①TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸 逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊 二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。
（五）柠檬酸发酵的产率
1、无CO2固定反应的产率 合成1分子柠檬酸需要3分子 乙酰辅酶A，也就是需要1.5 分子的葡萄糖。 理论产率为： 192 /( 180×1.5) = 71.1%
2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸
四、柠檬酸发酵过程的控制要点
（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的
(三)氧对柠檬酸积累的调节
乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一 个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它 对柠檬酸发酵的作用为： (1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。 (2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链 以外，还有一条侧系呼吸链。
当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧 系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。